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酵母转化常用培养基及程序精选

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酵母转化常用培养基及程序精选_第1页
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酵母转化常用培养基及程序 酵母实验操作方案 一.质粒酶切及线性化 1)用维特洁日常型小量DNA纯化试剂盒抽提9KSF2,可得到较纯的质粒10μg/3ml菌液,终体积80ul 2)线性化质粒 使用80μl酶切体系 9KSF2质粒70μl 内切酶(SacI,SalI,BglⅡ)2μl 10 x buffer 8μl 3)酶切3-16小时,一般3小时即可; 二.乙醇回收酶切质粒 1)2倍体积无水乙醇和0.1倍体积的3M NaAC(PH 5.2),混匀,沉淀DNA; 2)-200C数个小时(>2小时),13,200rpm离心10~20分钟,吸弃上清; 3)300ul 70%乙醇洗一次,13,200rpm离心10分钟,吸弃上清(注意离心管位置,从含有DNA的离心管另一侧吸取); 4)37℃烘干水分和残留乙醇; 5)用20μl ddH2O重溶; 6)1ul样品电泳检测DNA量,计算DNA总量; 三.电转化 1.准备感受态细胞 1)5ml YPD 接种GS115单菌落,250rpm,300C,摇菌24 hours; 2)100ml YPD,接种百分之一,同时留1ml空白YPD,300C ,250rpm,7~8hours,直到OD600=1.3~1.5; 3)菌液转入500ml离心管,JA14,1500g,40C离心5 min,弃上清; 4)100ml冰水重悬,同上离心,弃上清; 5)80~90ml冰水重悬,同上离心,弃上清; 6)20ml冰1M sorbitol 重悬,然后转移到50ml 离心管中,同上离心,弃上清; 7)约150μl 1M sorbitol重悬,40C备用,剩下的感受态细胞可以保存在-700C冰箱大约3周。

2.转化 1)100μl GS115感受态细胞加入+20μl 线性化质粒,用枪打匀; 2)冰浴5min,加入0.2cm转化杯中,轻轻将液体震到杯底,立即冰浴; 3) 电转化,参数设定:电压1500V 电容25μF电阻200欧姆,放电时间4~5ms 4)立即加650μl 冰1M sorbitol 入转化杯,打匀; 5) 迅速涂板,250μl/块MD板,共3块; 6) 涂好的板放在300C培养箱中培养4~5天,至菌落直径1mm即可 注: a)内为手册推荐量,相关文献报道,转化效率一般为103~104 / ugDNA,所需质粒量0.3-10ug不等; b)放电是可好出现电击穿现象,原因有:酵母浓度不够;DNA溶液离子浓度过大;混合液体积不够; c)MD板加入1M sorbitol ,转化时第2)步冰浴时间延长至1-2小时,均有利于提高转化效率 四.G418筛选多拷贝基因 1)取出长有克隆的3块板,可考虑先挑10-20个菌落先表达; 2)第一块加入2ml 灭菌的ddH2o,用涂布棒打匀,洗后,菌液吸入第二块; 3)第二块加入1ml,洗之,吸入第三块; 4)菌液吸入EP管,可适量补充ddH2o; 高压灭菌,冷却至60度,加 10×(NH4)2SO4100ml 1% 10×Glycerol 100ml 1% 500×biotin 2ml 4×10-5% BMMY: Yeast Extract 10g 1% Peptone 20g 2% YNB 3.4g 0.34% K2HPO4 3.013g KH2PO4 11.813g (PH6.0 缓冲液) dH2O 900ml 高压灭菌,冷却至60度,加 10×(NH4)2SO4100ml 1% 每次使用之前,分装后加2/1000体积 500×biotin 2ml 4×10-5% 连接产物的质粒转化 1)-700C取出Top10感受态细胞,50ul/管,取出后迅速分装城10ul或20ul/管; 2)冰浴30min; 3)420C,30秒(精确计时),置于冰水1-2min; 4)加等体积370C预热的SOC培养基; 5)370C,225rpm,培养45min; 6)100ul分别涂板,370C培养; 酵母转化常用培养基: 1、10*YNB(无氨基酸酵母氮源),134gYNB固体溶于1L蒸馏水,过滤灭菌,4℃保存 2、500*B(0.02%生物素),生物素20mg/100ml水,4℃保存; 3、10*D(20%葡萄糖),200GD-葡萄糖溶于1L水,过滤灭菌,4℃保存 4、10*GY(10%的甘油)100ml甘油溶于900ml水,过滤灭菌,4℃保存 5、100*AA(含每种氨基酸0.5%),称取L-谷氨酸L-蛋氨酸L-亮氨酸L-异亮氨酸L-赖氨酸各500mg 溶于100ml水过滤灭菌,4℃保存 酵母培养基 YPD完全培养基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium) 酵母提取物10g/L 蛋白胨20g/L 葡萄糖20g/L 琼脂15g/L 转化培养基RDB:(Regeneration Dextrose Medium+ Histidine)100mL 超纯水80ml 山梨醇18g(186g/L) 琼脂糖2g(20g/L) 121℃灭菌20分钟,待温度将至60℃以后,在超净台内加入10*YNB 10ml, 10*D(20%葡萄糖) 10ml, 500*B(0.02%生物素)0.2ml 100*AA(含每种氨基酸0.5%)1ml.混匀,倒平板。

选择培养基MD:(Minimal Dextrose Medium+ Histidine)100mL 向80 mL 超纯水中加入琼脂糖2g(20g/L) 121℃灭菌20分钟,待温度将至60℃以后,在超净台内加入10*YNB 10ml, 10*D(20%葡萄糖)10ml, 500*B(0.02%生物素)0.2ml,混匀,倒平板 选择培养基MM:(Minimal Methanol+ Histidine )100mL 向90 mL 超纯水中加入琼脂糖2g(20g/L) 121℃灭菌20分钟,待温度将至60℃以后,在超净台内加入10*YNB 10ml, , 500*B(0.02%生物素)0.2ml,5mL甲醇混匀,倒平板 诱导表达培养基BMGY (1L)(Buffer Glycerol-complex Medium) 酵母提取物10g/L 蛋白胨20g/L K2HPO4 3g/L KH2PO4 11.8G/L 超纯水890Ml 121℃灭菌20分钟,待温度将至60℃以后,在超净台内加入10*YNB 100ml, 500*B(0.02%生物素)1ml,甘油10mL 诱导表达培养基BMMY (1L)(Buffer Methanol-complex Medium) 酵母提取物10g/L 蛋白胨20g/L K2HPO4 3g/L KH2PO4 11.8G/L 超纯水895Ml 121℃灭菌20分钟,待温度将至60℃以后,在超净台内加入10*YNB 100ml, 500*B(0.02%生物素)1ml,5mL甲醇 电击杯处理: 用超纯水洗干净,检测,5.1以上,用无水酒精浸泡,大约1-2小时,超净台抽干,盖盖,放于-20℃备用。

电击仪操作:电源—程序4—2funal—5 (酵母) 电源—程序4—1b….—enter(细菌) 电击转化: 1 取80ul感受态放入10ul含有5-20ug的线型DNA中,然后放入0.2cm冰预冷的电击杯中,混匀, 静止5分钟 2电击转化 3转化完之后,立即放入1mL冰冷山梨醇 4取200-400ul涂板,在RDB平板 5 ℃℃30 感受肽细胞制备: 试剂制备:制备感受肽应提前预定离心机,并将温4℃ YPD培养基: 山梨醇1mol/L: 离心管50ml 大枪头5ml 无菌水 1挑取酵母受体菌的单菌落接种于10mlYPD培养基中,30℃摇床过夜 2以1 %接种量转接100mlYPD液体培养基,30℃摇床过夜至OD=1.3-1.534℃离心5000rpm,5min,弃上清 4用100ml冰预冷无均水将菌体重悬 54℃离心5000rpm,10min,弃上清 6用50ml冰预冷无均水将菌体重悬 74℃离心5000rpm,10min,弃上清。

8再用20ml 1 mol/L的山梨醇洗涤1次 溶于200ul 1mol/L的冰预冷的山梨醇,以备转化 。

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