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1、第四章第四章基本培养技术基本培养技术细胞基本培养技术内内容容第一节第一节玻璃器皿及塑料制品的清洗与消毒玻璃器皿及塑料制品的清洗与消毒第二节第二节培养操作的基本要领和要求培养操作的基本要领和要求第三节第三节细胞培养的基本技术细胞培养的基本技术细胞基本培养技术第一节第一节细胞培养所用玻璃及塑料细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒制品的清洗与消毒细胞基本培养技术一、清洗一、清洗vv目的：目的： 在组织细胞培养中，体外细胞对任何在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害有害物质物质都非常敏感都非常敏感, ,均能影响培养细胞的生长均能影响培养细胞的生长vv有害物质包括：有害物质包括：微生物产品附带杂物微生物
2、产品附带杂物 上次细胞残留物上次细胞残留物 非营养成分的化学物质非营养成分的化学物质需要清洗的培养用品需要清洗的培养用品玻璃器皿、胶塞、塑料制品玻璃器皿、胶塞、塑料制品细胞基本培养技术1 1、玻璃器皿的清洗、玻璃器皿的清洗vv包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤vv清洗后的玻璃器皿要求：清洗后的玻璃器皿要求：干净透明无油迹干净透明无油迹不能残留任何物质不能残留任何物质细胞基本培养技术v清洗：自来水洗，烘干清洗：自来水洗，烘干泡酸泡酸自来水洗自来水洗去离子水洗去离子水洗三蒸水洗三蒸水洗烘干烘干v新瓶子均按该程序清洗，培养材料染菌新瓶子均按该程序清洗，培养材料染菌的
3、瓶子经高压灭菌后也按该程序清洗。的瓶子经高压灭菌后也按该程序清洗。v酸液（洗液）：浓硫酸酸液（洗液）：浓硫酸+重铬酸钾重铬酸钾细胞基本培养技术vv浸泡：浸泡：vv初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉。掉。细胞基本培养技术vv新的初次使用的玻璃器皿新的初次使用的玻璃器皿vv先用自来水简单刷洗，然后用先用自来水简单刷洗，然后用5稀盐稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质vv培养瓶浸泡后还需要装满蒸馏水培养瓶浸泡后还需要装满蒸馏水后上高压！后上高压！细胞基本培养技术
4、再次使用的玻璃器皿：再次使用的玻璃器皿：用后立即浸入水中，要求完全用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液浸入，不能留有气泡或浮在液面上。面上。原因：常附有大量刚使用过的蛋白原因：常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉。质，干固后不易洗掉。细胞基本培养技术v刷洗：刷洗：用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质。着较牢的杂质。刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度细胞基本培养技术 浸酸：浸酸：vv玻璃器皿浸泡到清洁液中的过程玻璃器皿浸泡到清洁液中的过程玻璃器皿浸泡到清洁液中的过程玻璃器皿浸泡到清洁液中的
5、过程注意：浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器注意：浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器注意：浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器注意：浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面。皿露出清洁液面。皿露出清洁液面。皿露出清洁液面。浸泡时间：一般为过夜，不应少于浸泡时间：一般为过夜，不应少于浸泡时间：一般为过夜，不应少于浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 6 6 6 小时小时小时小时vv配制、浸泡时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，配制、浸泡时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，配制、浸泡时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，配制、浸泡时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露
6、部分。并要保护好面部及身体裸露部分。并要保护好面部及身体裸露部分。并要保护好面部及身体裸露部分。细胞基本培养技术vv冲洗冲洗在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹。使之尽量不留污染或清洁液的残迹。使之尽量不留污染或清洁液的残迹。使之尽量不留污染或清洁液的残迹。浸泡后的冲洗过程：浸泡后的冲洗过程：浸泡后的冲洗过程：浸泡后的冲洗过程：需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，需流水冲洗十次以上，每次
7、水须灌满及倒干净，需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，蒸馏水浸泡过夜，自来水冲洗蒸馏水浸泡过夜，自来水冲洗蒸馏水浸泡过夜，自来水冲洗蒸馏水浸泡过夜，自来水冲洗5 5 5 5遍，一蒸水遍，一蒸水遍，一蒸水遍，一蒸水5 5 5 5遍，遍，遍，遍，二蒸水二蒸水二蒸水二蒸水3 3 3 3遍，培养瓶要求二蒸水也用流水，烤干备遍，培养瓶要求二蒸水也用流水，烤干备遍，培养瓶要求二蒸水也用流水，烤干备遍，培养瓶要求二蒸水也用流水，烤干备用。用。用。用。细胞基本培养技术2 2、胶塞的清洗、胶塞的清洗vv新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理用
8、自来水冲洗，再做常规处理. .vv常规清洗方法常规清洗方法常规清洗方法常规清洗方法vv每次用后立即置入水中浸泡，用每次用后立即置入水中浸泡，用每次用后立即置入水中浸泡，用每次用后立即置入水中浸泡，用2%NaOH2%NaOH或洗或洗或洗或洗衣粉煮沸衣粉煮沸衣粉煮沸衣粉煮沸10-2010-20分钟（以除掉培养中的蛋白质），分钟（以除掉培养中的蛋白质），分钟（以除掉培养中的蛋白质），分钟（以除掉培养中的蛋白质），自来水冲洗，蒸馏水冲洗自来水冲洗，蒸馏水冲洗自来水冲洗，蒸馏水冲洗自来水冲洗，蒸馏水冲洗2-32-3次，晾干备用。次，晾干备用。次，晾干备用。次，晾干备用。细胞基本培养技术3 3、塑料制品的
9、清洗、塑料制品的清洗vv塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品。包装，打开包装即可用，多为一次性物品。vv必要时用必要时用2% NaOH 2% NaOH 浸泡过夜，用自来水充分浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用冲洗，再用5%5%盐酸溶液浸泡盐酸溶液浸泡30 30 分钟，最后分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。vv培养板、塑料离心管的清洗同玻璃器皿。但不能放在培养板、塑料离心管的清洗同玻璃器皿。但不能放在培养板、塑料离心管的清洗同玻璃器皿。但不能放在培养板、塑料离心管的清洗同玻璃
10、器皿。但不能放在烤箱中干燥！烤箱中干燥！烤箱中干燥！烤箱中干燥！细胞基本培养技术二、包装：二、包装：目的：以便消毒及储存，防止落人灰尘及消目的：以便消毒及储存，防止落人灰尘及消毒后再次被污染。毒后再次被污染。 包装纸（盒）表面用油性记号笔标明物包装纸（盒）表面用油性记号笔标明物品名称、消毒日期等！品名称、消毒日期等！ 细胞基本培养技术各种用品的包装各种用品的包装器皿的包装分为半包装和全包装器皿的包装分为半包装和全包装v培养瓶培养瓶 两个一组全包，包装前盖上螺旋盖子。两个一组全包，包装前盖上螺旋盖子。v吸管吸管 在与胶头相接端塞上棉花装入吸管筒。在与胶头相接端塞上棉花装入吸管筒。v青霉素小瓶青霉
11、素小瓶 倒扣在饭盒中，全包。倒扣在饭盒中，全包。v滤器滤器 上下口半包装再用报纸包，最后用布包好。上下口半包装再用报纸包，最后用布包好。v大的容器大的容器 如锥形瓶，加上棉塞后半包装。如锥形瓶，加上棉塞后半包装。v枪头、枪头、EPEP管管 装在相应的盒子中，全包。装在相应的盒子中，全包。v手术器械手术器械 放在饭盒中，全包。放在饭盒中，全包。v离心管离心管 加盖子后全包加盖子后全包细胞基本培养技术三、消毒、灭菌三、消毒、灭菌 防止培养物污染可通过消毒灭菌（将已存在的微防止培养物污染可通过消毒灭菌（将已存在的微生物去除）生物去除）灭菌灭菌sterilization：应用理化方法杀死所有病原微：应
12、用理化方法杀死所有病原微生物、非病原微生物和芽胞。生物、非病原微生物和芽胞。消毒消毒disinfection：应用理化方法杀死微生物，只：应用理化方法杀死微生物，只要求达到无传染性的目的，不要求全部杀死。要求达到无传染性的目的，不要求全部杀死。细胞基本培养技术无菌无菌germfree：没有活菌。：没有活菌。防腐防腐antisepsis：应用理化方法防止和抑制微：应用理化方法防止和抑制微生物生长繁殖。生物生长繁殖。抑菌（抑菌（bacteriostasis）：抑制体内或体外细）：抑制体内或体外细菌生长繁殖。常用的抑菌剂为抗生素菌生长繁殖。常用的抑菌剂为抗生素细胞基本培养技术1、消毒灭菌的方法消毒灭
13、菌的方法 物理方法物理方法: : 湿热（高压蒸汽）、干热、紫外线。射湿热（高压蒸汽）、干热、紫外线。射线、过滤、离心沉淀等方法杀灭或去除微生物。线、过滤、离心沉淀等方法杀灭或去除微生物。 化学方法化学方法: :使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。 细胞基本培养技术2、消毒灭菌的注意事项、消毒灭菌的注意事项 干热消毒：一般在烤箱中进行，需加温到干热消毒：一般在烤箱中进行，需加温到 160 160，保持，保持9090120 min120 min方能杀死芽孢。方能杀死芽孢。注意！注意！消毒完毕后不可马上将烤箱门打开，以免冷空气突消毒完毕后不可马上将烤箱门打开，以免
14、冷空气突然进人，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外然进人，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外事故。事故。细胞基本培养技术湿热消毒：一般使用高压蒸汽灭菌器进行湿热消毒：一般使用高压蒸汽灭菌器进行消毒。消毒。v注意：注意：1、不能装太满，保持消毒器内气体流通。、不能装太满，保持消毒器内气体流通。2、在加热升压之前，打开排气阀门，使加热、在加热升压之前，打开排气阀门，使加热后消毒器内的残留冷空气排出！后消毒器内的残留冷空气排出！关闭排气阀门，开始升压，待达到所需要的关闭排气阀门，开始升压，待达到所需要的压力时，开始记录时间，并控制压力恒定。压力时，开始记录时间，并控制压力恒定。细胞基本培养技术3
15、、一般物品：布类、金属器械、玻璃器皿等消毒、一般物品：布类、金属器械、玻璃器皿等消毒的要求是的要求是15磅磅20min；v常规使用液体：消毒常规使用液体：消毒15磅磅15min。4、橡胶和塑料用品橡胶和塑料用品 ： 如滤器、如滤器、EPEP管、离心管等高压管、离心管等高压1010磅磅15 min15 min。 细胞基本培养技术紫外线消毒：主要用于实验室房间里的空气、操作紫外线消毒：主要用于实验室房间里的空气、操作台表面及桌椅等消毒。时间为台表面及桌椅等消毒。时间为3030分钟分钟2 2小时左右。小时左右。过滤除菌消毒：过滤除菌消毒：适用于组织细胞培养使用的液体如血清、合成培养液、适用于组织细胞
16、培养使用的液体如血清、合成培养液、酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等。酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等。细胞基本培养技术3、常用设施的消毒及灭菌、常用设施的消毒及灭菌v培养室：紫外线照射、乳酸熏蒸培养室：紫外线照射、乳酸熏蒸v台面：紫外线照射、台面：紫外线照射、70%乙醇擦拭乙醇擦拭v培养箱：新洁尔灭擦拭培养箱：新洁尔灭擦拭v培养瓶、培养皿等：用报纸包好高压蒸汽培养瓶、培养皿等：用报纸包好高压蒸汽灭菌灭菌v滴管、枪头等：装载相应的容器中用报纸滴管、枪头等：装载相应的容器中用报纸包好高包好高压蒸汽灭菌压蒸汽灭菌v培养板：紫外线照射培养板：紫外线照射12小时以上。小时以上。v培养基：过滤除菌培养基：过滤除菌、 细胞基本培养技术第二节第二节培养操作基本要领和要求培养操作基本要领和要求v防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。由防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。由于体外培养细胞缺乏抗感染能力，故在一切操作于体外培养细胞缺乏抗感染能力，故在一切操作中要努力做到最大限度的无菌。中要努力做到最大限度的无菌。一、培养前准备一、培养前准备1、制定出分门别类的操作卡片。、制定出分门别类的操作卡片。
