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1、人教版高中生物选修一专题五DNA和蛋白质技术知识点归纳 人教版高中生物选修一专题五D N A和蛋白质技术知 识点归纳 Prepared on 22 November 2022 专题五和蛋白质技术 课题一的粗提取与鉴定 一、提取DNA的溶解性原理包括哪些方面 在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒 精。 DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点要使 DNA溶解，需要使用什么浓度要使DNA析出，又需要使 用什么浓度 在L时溶解度最小；较高浓度可使DNA溶解；L可使DNA析出。 在溶解细胞中的DNA时，人们通常选用2mol/LNaCl溶液；将DNA分子析出的方法是向溶有DNA的NaC
2、l溶液中缓慢注入蒸馏水，以稀释NaCl溶液。酒精是一种常用有机溶剂，但DNA却不能溶于酒精（特别是95冷却酒精），但细胞中蛋白质可溶于酒精。 2.从理论上分析，预冷的乙醇溶液具有以下优点。 一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解； 二是降低分子运动，易于形成沉淀析出； 三是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。 3.采用DNA不溶于酒精的原理，可以达到什么目的 将DNA和蛋白质进一步分离。 4.提取DNA还可以利用DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性原理。利用该原理时，应选用怎样的酶和怎样的温度值 蛋白酶，因为酶具有专一性，蛋白酶只水解蛋白质而不会对DNA产生影响。温度值为6080，因为该温度
3、值蛋白质变性沉淀，而DNA不会变性。补充：DNA的变性是指DNA分子在高温下解螺旋，其温度在80以上，如在PCR技术中DNA变性温度在95。 5.洗涤剂在提取DNA中有何作用 洗涤剂将细胞膜上的蛋白质，从而瓦解细胞膜。 6.当鉴定提取出的物质是否是DNA时，需要使用什么指示剂进行鉴定在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色。 原理总结：通过利用不同浓度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以从细胞中提取和提纯DNA；再利用酒精进一步将DNA与蛋白质分离开来，达到提纯的目的；最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否是DNA。 二、实验材料的选取 不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时，应本着DNA含量
4、高、材料易得、便于提取的原则。 本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因。 一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得； 二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。 鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液。 三、破碎细胞，获取含DNA的滤液 1、若选用鸡血和洋葱作实验材料，则怎样获取含DNA的滤液 在鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并用玻棒搅拌，过滤后收集滤液；切碎洋葱，加入一定量洗涤剂和食盐，搅拌研磨，过滤后收集滤液。 2.为什么加入蒸馏水能使
5、鸡血细胞破裂 答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。 3在以上实验中，加入蒸馏水、洗涤剂和食盐的作用分别是什么过滤时应当选用（滤纸、尼龙布）。血细胞在蒸馏水中大量吸水而张裂；洗涤剂瓦解细胞膜；食盐溶解DNA物质；选用尼龙布进行过滤。 4.在处理植物组织时需要进行研磨，其目的是什么研磨不充分产生什么结果 破碎细胞壁，使核物质容易溶解在NaCl溶液中；研磨不充分会使DNA的提取量减少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。 具体做法。10mL鸡血
6、20mL蒸馏水同方向搅拌3层尼龙布过滤滤液 三、去除滤液中的杂质 1.为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质 用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。 最初获得的DNA滤液含有蛋白质、脂质等杂质，需要进一步提纯DNA。 方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。 方案二与方案三的原理有什么不同 答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DN
7、A与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。 四、析出与鉴定 1.在滤液中仍然含有一些杂质，怎样除去这些杂质呢得到的DNA呈何颜色滤液与等体积的冷却酒精混合均匀，静置23分钟，析出的白 色丝状物就是DNA。DNA呈白色。 2.怎样鉴定析出的白色丝状物就是DNA呢 具体做法。试管2支，编号甲乙各加等量5mLNaCl溶液 甲中放入少量白色丝状物，使之溶解各加4mL二苯胺，混 合均匀沸水浴5min观察颜色变化 五、实验操作 制备鸡血细胞液加柠檬酸钠，静置或离心 破碎细胞，释放DNA加蒸馏水，同一方向快速通方向搅拌 过滤，除去细胞壁、细胞膜等。 溶解
8、核内DNA加入NaCl至2mol/L，同一方向缓慢搅拌 DNA析出加蒸馏水至L，过滤，在溶解到2mol/L溶液中 除去细胞质中的大部分物质。 DNA初步纯化与等体积95冷却酒精混合，析出白色丝状物 除去核蛋白、RNA、多糖等。 DNA鉴定二苯胺，沸水浴，呈现蓝色 注意事项：在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固；鸡血静置或离心以提高细胞悬液浓度；使用塑料烧杯；使用尼龙布过滤；玻棒沿同一方向搅拌；玻棒搅拌要缓慢（细胞破裂快速搅拌）；玻棒不要碰到烧杯壁；二苯胺试剂要现用现配等。 课题二多聚酶链式反应扩增DNA片段 基础知识 PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似： 1细胞内DNA复制条件分析
9、： 条件组分作用 模板DNA的两条单链提供复制的模板 原料四种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料 酶解旋酶 DNA聚合酶 打开DNA双螺旋 催化合成DNA子链 能量ATP 为解螺旋和合成子链供能 引物RNA 为DNA聚合酶提供合成的3端起点 2细胞内DNA复制过程的解析： 解旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，形成两条DNA单链。 引物结合：在DNA单链3端与DNA反向配对结合。 DNA聚合酶结合：DNA聚合酶与模板链结合，标志着单链合成开始。 子链合成：DNA聚合酶从引物3端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。 后续加工：D NA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不
10、连续的DNA子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链） 3 DNA分子复制的人工控制 实验操作步骤 照PCR反应体系配方配制反应液； 将PCR反应体系50L用微量移液器转移到微量离心管（）中； 将微量离心管放到PCR仪中； 设置PCR仪的工作参数。 DNA在PCR仪中大量扩增。 4实验注意事项 （1）避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。 （2）缓冲液和酶分装成小份，20低温保存。 （3）每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。 （4）混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。 总结、点评 蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千
11、差万别，由此提取和分离各种蛋白质。 1凝胶色谱法（分配色谱法）： （1）原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。 （2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 （3）分离过程： 混合物上柱洗脱大分子流动快、小分子流动慢收集大分子收集小分子洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。 （4）作用：分离蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。 2缓冲溶液 （1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3NaHCO3， NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的
12、缓冲液。（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。 3凝胶电泳法： （1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。 （2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 （3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。二、实验步骤 1样品处理 红细胞的洗涤 洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗
13、红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。 血红蛋白的释放 在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。 注：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。 2粗分离 分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 透析 取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中，透析12h。透析可以去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。 3纯化 调节缓冲液面：打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝 胶面平齐，关闭出口。 加入蛋白质样品：用吸管将透析后的样品沿管壁环绕移动加到色谱柱的顶端。加样后， 打开下端出口，使样品渗入凝胶
