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1、色谱分析法导论色谱分析法导论Guide of Chromatography知识目标：知识目标：J理解和掌握色谱分析的基本原理；理解和掌握色谱分析的基本原理；J熟悉色谱分析中的常用术语；熟悉色谱分析中的常用术语；J理解色谱分离基本理论（塔板理论和速率理论）；理解色谱分离基本理论（塔板理论和速率理论）；J熟悉影响色谱柱效能、分离度的因素；熟悉影响色谱柱效能、分离度的因素；J掌握色谱分析的定性、定量方法。掌握色谱分析的定性、定量方法。能力目标能力目标熟悉色谱流出曲线，能利用色谱流出曲线计算分离度；熟悉色谱流出曲线，能利用色谱流出曲线计算分离度；熟练掌握色谱峰的定性方法；熟练掌握色谱峰的定性方法；掌握
2、归一化法、内标法和外标法的定量分析方法。掌握归一化法、内标法和外标法的定量分析方法。第一节第一节 色谱基本原理及分类色谱基本原理及分类一、色谱法简介一、色谱法简介一、色谱法简介一、色谱法简介1906年由俄国植物学家茨维特首先年由俄国植物学家茨维特首先提出；提出；1930年后得到快速发展；年后得到快速发展；1950年英国生物学家马丁等创立了年英国生物学家马丁等创立了气相色谱法，并建立了其理论；气相色谱法，并建立了其理论；目前已发展成完善的现代分离分析目前已发展成完善的现代分离分析技术。技术。俄国植物学家茨维特的实验：俄国植物学家茨维特的实验：8在一根玻璃柱中装入细颗粒的碳酸钙固体，将其与吸滤瓶连
3、接；在一根玻璃柱中装入细颗粒的碳酸钙固体，将其与吸滤瓶连接；8用石油醚萃取干树叶中的叶绿素，将萃取液从玻璃管上端加入，用石油醚萃取干树叶中的叶绿素，将萃取液从玻璃管上端加入，色素物质便被吸附在碳酸钙填料柱上；色素物质便被吸附在碳酸钙填料柱上；8用石油醚自上而下冲洗，随着石油醚的加入，色素物质不断地向用石油醚自上而下冲洗，随着石油醚的加入，色素物质不断地向下移动，因不同色素被碳酸钙吸附的作用不同而逐渐分成几个不下移动，因不同色素被碳酸钙吸附的作用不同而逐渐分成几个不同颜色的谱带，证明这个玻璃柱有分离不同叶绿素的功能，由此同颜色的谱带，证明这个玻璃柱有分离不同叶绿素的功能，由此创造了一个新名词创造
4、了一个新名词“色谱色谱”；8其中装填了填料的玻璃管称为色谱柱，柱中的填料物质称为固定其中装填了填料的玻璃管称为色谱柱，柱中的填料物质称为固定相，相对于固定相运动、流经固定相的空隙或表面的冲洗溶剂称相，相对于固定相运动、流经固定相的空隙或表面的冲洗溶剂称为流动相。为流动相。色谱法：一种分离分析方法。色谱法：一种分离分析方法。利用各物质在两相中具有不同利用各物质在两相中具有不同的分配系数，当两相作相对运的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质在两相中进行动时，这些物质在两相中进行反复多次的分配来达到分离的反复多次的分配来达到分离的目的。目的。二、二、色谱分离基本原理色谱分离基本原理b固定相：固定不
5、动的一相。固定相：固定不动的一相。b流动相：携带试样混合物流过固定相的流体。流动相：携带试样混合物流过固定相的流体。色谱法特点：色谱法特点：选择性好；选择性好；分离效能高；分离效能高；灵敏度高；灵敏度高；分析速度快；分析速度快；定性困难；定性困难；应用广泛。应用广泛。三、色谱法分类三、色谱法分类（一）（一）按两相所处的状态分类按两相所处的状态分类1、气相色谱（流动相为气体）：、气相色谱（流动相为气体）：GC气气固色谱（固色谱（GSC）；）；气气液色谱（液色谱（GLC）2、液相色谱（流动相为液体）：、液相色谱（流动相为液体）：LC液液液色谱（液色谱（LLC）；）；液液固色谱（固色谱（LSC）3、
6、超临界流体色谱：、超临界流体色谱：以超临界流体为流动相，以固体或以超临界流体为流动相，以固体或液体为固定相的色谱法。超临界流体是指温度和压力在超液体为固定相的色谱法。超临界流体是指温度和压力在超临界温度和超临界压力之上的流体。临界温度和超临界压力之上的流体。（二）（二）按固定相的形式分类按固定相的形式分类1 1、柱色谱：、柱色谱：固定相装在柱内，被分离的样品沿一个方向移动而固定相装在柱内，被分离的样品沿一个方向移动而进行分离的方法。进行分离的方法。填充柱色谱：填充柱色谱：固定相填充在一玻璃或金属管中。固定相填充在一玻璃或金属管中。毛细管柱色谱：毛细管柱色谱：固定相涂敷在空心管内壁上。固定相涂敷
7、在空心管内壁上。2 2、平面（板）色谱：、平面（板）色谱：固定相呈平面状。固定相呈平面状。纸色谱：纸色谱：固定相为滤纸，把试样点在滤纸上，用溶剂将其展开，固定相为滤纸，把试样点在滤纸上，用溶剂将其展开，达到分离。达到分离。薄层色谱：薄层色谱：将固定相研成粉末，再在玻璃板上压成或涂成薄膜，将固定相研成粉末，再在玻璃板上压成或涂成薄膜，其余同纸色谱。其余同纸色谱。柱色谱柱色谱平面色谱平面色谱（三）按分离的原理分类（三）按分离的原理分类71 1、吸附色谱：、吸附色谱：固定相为吸附剂，根据不同组分在吸附固定相为吸附剂，根据不同组分在吸附剂上的吸附和解吸能力的大小而分离。剂上的吸附和解吸能力的大小而分离
8、。72 2、分配色谱：、分配色谱：根据不同组分在固定液中溶解度大小而根据不同组分在固定液中溶解度大小而分离。分离。73 3、离子交换色谱：、离子交换色谱：固定相为离子交换剂，可分离离子固定相为离子交换剂，可分离离子型化合物。型化合物。74 4、凝胶色谱：、凝胶色谱：用化学惰性的多孔性物质作固定相。根据用化学惰性的多孔性物质作固定相。根据不同组分分子量大小而进行分离。水或水溶液为流动相称不同组分分子量大小而进行分离。水或水溶液为流动相称凝胶过滤色谱；有机溶剂作流动相为凝胶渗透色谱。凝胶过滤色谱；有机溶剂作流动相为凝胶渗透色谱。75 5、电色谱法：、电色谱法：利用带电物质在电场作用下移动速度不同利
9、用带电物质在电场作用下移动速度不同进行分离的色谱法。进行分离的色谱法。76 6、亲和色谱：、亲和色谱：以共价键将具有生物活性的配位体结合到以共价键将具有生物活性的配位体结合到不溶性固体支持物或基质上作固定相。根据蛋白质或大分不溶性固体支持物或基质上作固定相。根据蛋白质或大分子与配位体之间特异的亲和力而进行分离。子与配位体之间特异的亲和力而进行分离。（三）按分离的原理分类（三）按分离的原理分类第二节第二节 色谱分离过程与术语色谱分离过程与术语8一、色谱分离过程一、色谱分离过程8当流动相中所含混合物经过固定相时，就会与固定相发生当流动相中所含混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用。作用。8各组分
10、在性质和结构上的差异，流动相与固定相发生作用各组分在性质和结构上的差异，流动相与固定相发生作用的大小、强弱也有差异。的大小、强弱也有差异。8在同一推动力的作用下，不同组分在固定相中的滞留时间在同一推动力的作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后不同的次序从固定相中流出。有长有短，从而按先后不同的次序从固定相中流出。 吸吸 附附脱脱 附附再吸附再吸附再脱附再脱附反复多次平衡反复多次平衡被测组分被测组分分分 离离色色谱谱分分离离过过程程二、色谱二、色谱流出曲线（流出曲线（chromatogramchromatogram）8色谱流出曲线：色谱流出曲线：试样从进样开始，试样中的各组分经
11、色谱试样从进样开始，试样中的各组分经色谱柱分离后，按先后次序随流动相一起流出色谱柱，经过检柱分离后，按先后次序随流动相一起流出色谱柱，经过检测器，检测器将流动相中各组分浓度（或含量）的变化转测器，检测器将流动相中各组分浓度（或含量）的变化转变为相应的电信号，由记录仪记录下信号变为相应的电信号，由记录仪记录下信号 时间曲线或信时间曲线或信号号 流动相体积曲线，称为色谱流出曲线，又称色谱图。流动相体积曲线，称为色谱流出曲线，又称色谱图。8色谱图横坐标为时间（色谱图横坐标为时间（minmin或或s s）；）；纵坐标为检测信号的纵坐标为检测信号的毫伏值（毫伏值（mVmV）。 色谱流出曲线色谱流出曲线色
12、谱图色谱图色谱流出曲线提供的重要信息：色谱流出曲线提供的重要信息：根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组份的最少根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组份的最少个数；个数；根据色谱峰的保留值根据色谱峰的保留值( (或位置），可以进行定性分析；或位置），可以进行定性分析； 根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；色谱峰的保留值及其区域宽度是评价色谱柱效能的依色谱峰的保留值及其区域宽度是评价色谱柱效能的依据；据；色谱峰两峰间的距离是评价固定相和流动相选择是否色谱峰两峰间的距离是评价固定相和流动相选择是否合适的依据。合适的依据。8（一）基线（一）基线（bas
13、e linebase line）：）：8操作条件稳定后，仅有流动相通过检测器时，仪器记录到操作条件稳定后，仅有流动相通过检测器时，仪器记录到的检测器噪声随时间变化的线称为基线。的检测器噪声随时间变化的线称为基线。8基线反映了检测器噪声随时间的变化。基线反映了检测器噪声随时间的变化。8稳定的基线应是一条直线。稳定的基线应是一条直线。三、色谱常用术语三、色谱常用术语81 1、峰高、峰高HH（peak heightpeak height）：）：色谱峰顶点到基线的色谱峰顶点到基线的垂直距离垂直距离 。用。用mvmv、mmmm表示。表示。82 2、峰面积、峰面积A A：色谱峰曲线与峰底基线所围成区域面色
14、谱峰曲线与峰底基线所围成区域面积积 。（二）（二）峰高（峰高（H H）和峰面积（）和峰面积（A A）81 1、标准偏差、标准偏差 ：色谱峰峰高色谱峰峰高0.6070.607倍处对应的峰宽的倍处对应的峰宽的一半。一半。82 2、半峰宽、半峰宽WW1/21/2：峰高一半处所对应的峰宽。峰高一半处所对应的峰宽。83 3、峰底宽、峰底宽WW：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离间的距离 ，也称基线宽度。，也称基线宽度。WW44。 （三）色谱峰区域宽度（三）色谱峰区域宽度（四）保留值（四）保留值81 1、死时间、死时间t tMM（deaddead time time）
15、：）：不与固定相作用的物质从不与固定相作用的物质从进样开始到柱后出现峰极大值时的时间进样开始到柱后出现峰极大值时的时间（minmin、s s或或mmmm、cmcm） 。它与色谱柱的空隙体积有关。它与色谱柱的空隙体积有关。82 2、保留时间、保留时间t tR R（retentionretention time time）：）：待测组分从进样开待测组分从进样开始到柱后出现其色谱峰极大值时的时间。始到柱后出现其色谱峰极大值时的时间。83 3、调整保留时间、调整保留时间t tR R：扣除了死时间的保留时间，即组分扣除了死时间的保留时间，即组分在固定相上滞留的时间。在固定相上滞留的时间。（四）保留值（四
16、）保留值84 4、死体积、死体积V VM M （dead volumedead volume） ：指不被固定相保留的指不被固定相保留的组分从进样开始到柱后出现浓度极大值时的体积，即通组分从进样开始到柱后出现浓度极大值时的体积，即通过色谱柱所消耗的流动相的体积，又指色谱柱未被固定过色谱柱所消耗的流动相的体积，又指色谱柱未被固定相所占据的空隙体积。相所占据的空隙体积。 85 5、保留体积、保留体积V VR R：从进样开始到该组分在柱后出现浓度从进样开始到该组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。极大点时所通过的流动相的体积。86 6、调整保留体积、调整保留体积V VR R：保留体积与死体积之差。保留体积与死体积之差。8 V VR R = = V VR R V VMM（四）保留值（四）保留值87 7、相对保留值（相对保留值（r r2,12,1) )：组分组分2 2与组分与组分1 1的调整保留值之比。的调整保留值之比。88 8、选择性因子、选择性因子 ：相邻两组分调整保留值之比。相邻两组分调整保留值之比。 （五）分配系数和分配比（五）分配系数和分配比8分配系数分配系数（distribu
