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1、细胞冻存、解冻方法与细胞计数江苏大学附属医院 风湿科 李晶 返回主页 一、细胞冷冻保存1.材料：生长良好之培养细胞、新鲜培养基、MO（iga D2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalne 500-20）、。4%(/）trypan be(GboBRL1561)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KYO10SeriI)2、冷冻保存方法：（1）传统方法： 冷存管置于410分钟030分钟-8016小时（或隔夜）-液氮槽vaporhase长期储存。-不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大,造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入80冰箱中，惟存活率稍微降低一些.（2）程序降温:利用已设定程序的等速降温机以1-
2、分钟之速度由室温降至(8以下）12,再放在液氮槽vapope长期储存。适用于悬浮型细胞与hbima之保存。3、步骤：（)冷冻前2448小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期.（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制):另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜(DMSO)至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用.（3）离心收集培养之细胞,用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液（约0。1l)计数细胞浓度及冻前存活率。（4）取与细胞悬液等量的冻存液,缓慢逐滴加入细胞悬液,并晃动试管，制成细胞冻存悬液（MO最后浓度为51)，使细胞浓度为06cls/ml，混合均匀，分装于已标示
3、完全之冷冻保存管中，12m/vil，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。4、注意事项:(1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logpae）且存活率高之状态,约为80致密度.冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。()细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力;在70度可保存数月.(3）注意冷冻保护剂之品质.M应为试剂级等级，无菌且无色（以0。2micro FGL Telfo过滤或是直接购买无菌产品,如Sima D20)，以510l小体积分装,避光保存,勿作多次解冻.lycerl亦应
4、为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液,可避免S直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗,可降低细胞受损.DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化,可换用10%甘油冻存.（）冷冻保存之细胞浓度：noml umn fibrolast：316clls/mlhybridoma：116cellsml，细胞浓度不要太高,某些ybidoa会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。adhernt umolnes：57106,依细胞种类而异。dencarinom解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1106cl
5、smther supensions：51010cels/，hum phoce须至少516cls/ml.(）冷冻保护剂浓度为5或10%DMS，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个bacup cult，以防止冷冻失败。（6）冻存可用00的血清,一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20终浓度有利于细胞悬浮而少沉积（度时），复苏存活率在80%9%以上,对原代培养细胞,以90血清冻存更为有效。二、冷冻细胞活化1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻,以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常（例如产生单
6、株抗体或是其它蛋白质）。3、材料3恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器4、步骤：（）操作人员应戴防护面罩及手套,防止冷冻管可能爆裂之伤害。（2)自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧,由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉.（3)将新鲜培养基置于37水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之,移入无菌操作台内。(）取出冷冻管，立即放入37水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在分钟内全部融化,以%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。(5)取出解冻之细胞悬浮液,缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:11：15），混合均匀,放入培养箱培养.取.1ml解冻细胞悬浮液作存活测
7、试。(6）解冻后是否立即去除冷冻保护剂（例如DSO或lyco）,依细胞种类而异,一般而言,大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除,则将解冻之细胞悬浮液加入含有510ml培养基之离心管内，离心100rp，5分钟，移去上清液,加入新鲜培养基,混合均匀，放入CO2培养箱培养。(）若不需立即去除冷冻保存剂,则在解冻培养后隔日更换培养基。三、细胞计数与存活测试1、原理：（)计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercote粒子计数器自动计数。()血球计数盘一般有二个ambrs,每个camer中细刻9个mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0。1mm。当chamber上方盖
8、上盖玻片后，每个大正方形之体积为mmm=1。01-。使用时,计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数,再乘以14，即为每l中之细胞数目。（3）存活测试之步骤为yexclsion,利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan bu染料,如果细胞不易吸收trypn lue，则用红色之rythrosinbish。计算细胞活率:活细胞数(活细胞数死细胞数）100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长,部分活细胞也开始摄取染料;因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。2、材料:04%w/v ryn
9、 bu（GibcoBRL15250）;Eryhsin buish stai;取0。raEhrosn bluis（iga-9259)及0。5gampreevative meyren（SigmaH-3647)溶于100mCa+M+realie；血球计数盘及盖玻片（Hemocytometerandcoverslip）；计数器（ounter）;低倍倒立显微镜；粒子计数器(Coultercount,uleElcois)。白细胞稀释液(4乙酸溶液）。3、步骤:（）取5l细胞悬浮液与50l trpan blu(orErtrsnbluish)等体积混合均匀于。5ml小离心管中。(2）取少许混合液(约15l)自
10、血球计数盘aber上方凹槽加入,盖上盖玻片,于0倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色Erytrosin blui）。（3)计数四个大方格之细胞总数，再除,乘以稀释倍数（至少乘以，因与typanblue等体积混合),最后乘以0,即为每中细胞悬浮液之细胞数.若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞（或计下线与左线之细胞)。注：4大格细胞总数稀释倍数104/=细胞数/ml；每一大格的体积0.1m0。1cm0。01cm=104m计数板计数时，最适浓度为510105细胞/ml，此范围外计数误差偏大.高浓度细胞悬液,可取出部分作稀释或连续稀释后计数。5、范例：T75 mooayr cltue制成10m细胞悬浮液,取。1l溶液与0.ml trpa u混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。活细胞数方格:55，6,9，59；死细胞数/方格:，3，6；细胞总数=43平均细胞数/方格=6.75;稀释倍数=2；细胞数/ml：605042（稀释倍数）12206；细胞数/flsk(10ml)：1.2210610m=2216存活率:22/249.6细胞冻存的方法与步骤
