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1、单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式* *1 1药品微生物限度检查控制菌检查菌种分离鉴定流程n增菌n分纯n初步鉴别试验n革兰染色n生化试验n酶类试验n抗生素敏感性试验（用于菌种鉴定）n全面鉴定n血清分型n毒素分析n基因分型n蛋白组分析n自动化仪器分析（生化，酶学，基因序列等）20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六2 2中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室2 供试品的制备n参看药典微生物限度检查法n有抑菌活性的检品应进行预处理n稀释法n离心沉淀集菌法 3000r/min离心30min，有不溶性沉渣先500r/min离心5minn薄膜过滤法 0
2、.45um 0.02 100mln中和法 磺胺类100ml中15ml1%对氨基苯甲酸；砷汞，硫乙醇酸盐；洗必泰，聚山梨醇酯80n自然沉降法 难溶于水的抗菌制剂n同时做阳性和阴性对照n了解常用的培养方法和常用培养基上各控制菌菌落特征，知道如何进行菌种分纯，以便于进行下面的试验20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六3 3中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室3 革兰染色、镜检n3.1 操作步骤n3.1.1 制片-过火固定，避免水冲，破坏细胞结构使染料易透过n3.1.2 结晶紫染色-1分n3.1.3 碘液媒染-1分n3.1.4 乙醇脱色-30秒n3.1.5 沙黄
3、复染-30秒20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六4 4中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室3.2 染色结果n革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。可以分别用金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌作质控株20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六5 5中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室3.3 革兰染色注意事项n3.2.1 玻片必须洁净n3.2.2 涂片菌量宜少，菌不可浓n3.2.3 新鲜培养物n3.2.4 脱色是关键20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六6 6中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗
4、生素室3.3 革兰染色意义n3.3.1 初步识别细菌，利于进一步鉴定n3.3.2 初步选择治疗用药物n3.3.3 与致病性相关，阳性以外毒素为主，阴性菌以内毒素为主20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六7 7中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室4 触酶试验n触酶试验不应当在含血的碟子上（用上面的菌落试验应小心）进行因为红细胞中含有触酶可能导致假阳性出现n用于检测细菌是否生成过氧化氢酶，是否利于在有氧环境中生长n细菌在有环境中代谢可以生成超氧离子和过氧化氢，具有杀菌作用，能生成触酶的菌种容易耐氧。但厌氧菌有产生触酶者，某些非厌氧菌触酶也不产生（链球菌，此试
5、验可用于菌种鉴别）20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六8 8中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六9 9中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室5 氧化酶试验n5.1 试验方法：滤纸，无菌玻璃棒，1滴新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液n5.2 结果判定：30s，培养物出现粉红色逐渐变为紫红色，即为氧化酶试验阳性反应。若培养物不变色或仅显粉色为阴性反应20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六1010中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室试验阳性图
6、示20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六1111中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室5.3 氧化酶试验注意事项n5.3.1 试验菌落(苔)必须新鲜，陈旧培养物反应不可靠n5.3.2 试验避免与铁、镍等金属接触，否则易出现假阳性。宜用玻璃棒或木棒n5.3.3 试剂宜新鲜配制，放置过久，二盐酸二甲基对苯二胺氧化变色不可用n5.3.4 反应需在有氧条件下进行，勿滴加试剂过多，以免浸泡培养物使之与空气隔绝，造成假阴性反应n5.3.5 含糖培养基上的菌落不适于做氧化酶试验，因为糖分解产酸抑制氧化酶活性20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六1212中
7、国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室6 血浆凝固酶试验简介n主要用于金黄色葡萄球菌的鉴定n分为两大类，结合凝固酶和游离凝固酶n检测以试管法为参考方法20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六1313中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室6 凝固酶试验操作方法n无菌试管(10100mm)3支，加入血浆和0.9%无菌氯化钠溶液(1：1) 各0.5ml，1支加入被检菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml，作为检品管；其余2支作对照管：1支加入金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作为阳性对照；另一支加入营养肉汤或0
8、.9%无菌氯化钠溶液0.5ml作阴性对照n三管同时置361水浴或恒温培养箱，3h后开始检查，以后每隔适当时间观察一次，直至24h20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六1414中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室6 凝固酶试验的注意事项n血浆凝固酶试验应用新鲜培养物及新鲜血浆。如用陈旧培养物及血浆(纤维蛋白常已析出)易导致假阴性反应n用试管法检查时，轻轻将试管倾斜，(动作勿大，防止江凝块摇碎)仔细观察n试验时间过长容易导致假阴性20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六1515中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室6 凝固
9、酶试验的结果判定n阴性对照管血浆流动自如，阳性对照管液呈凝固状，试验管液呈凝固者为阳性反应；不凝固为阴性反应。阳性对照管和阴性对照管任何一管不符合要求时，应另制备血浆，重新试验n目前商品化的凝固酶试剂多家微生物相关制剂公司有售，试剂具有较好的稳定性、准确性20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六1616中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室7 生化试验n细菌鉴定的传统方法，参考方法n因为针对不同菌种，选择有针对性的生化试验进行，菌种不同所作的试验不同，药品检验中常用的种类不再一一介绍，所以在以后各菌种鉴定内容当中单独讨论n所有试验都需要已知阳性和阴性的菌株作
10、为质控菌株，定期对试剂、培养基（包括培养基的灵敏度试验）以及试验操作过程进行质控试验，保证结果解释的准确性20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六1717中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室8 自动化仪器n优点：n包含的菌种的生物学特性测试试验种类更多，可以提高菌种鉴定的准确率n缩短菌种鉴定所需要的时间，为检品的快速检验提供保证n细菌鉴定的酶学技术以及近红外技术等其他鉴定方法应用的研究将为药品微生物鉴定提供更多的选择和便利20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六1818中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室nB-D公司的
11、phenix系统、生物梅里埃公司的VITEK系统等20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六1919中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室生化鉴定20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六2020中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室一、大肠杆菌检查法 20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六2121中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室1 简述n大肠杆菌即大肠埃希菌（Escherichiacoli），为肠杆菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，还有蟑螂埃希菌等四个种n大肠埃希菌是人
12、和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠杆菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠杆菌n大肠埃希菌除普通大肠杆菌外尚有致病性大肠杆菌、产毒性大肠杆菌、溶血性大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌等，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻、结膜炎等病症20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六2222中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室2 对照用菌液n菌种为大肠杆菌（）44102n对照菌液加入量含菌50100cfu（一般用量为0.1ml）n制作方法：营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，36
13、1培养1824h后，用0.9无菌氯化钠溶液稀释至1：106n其用途：n做阳性对照n检查培养基灵敏度20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六2323中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室3 操作步骤20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六2424中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室3.1 增菌培养n取胆盐乳糖（）培养基3瓶，每瓶各100mln2瓶分别加入规定量的供试液，其中1瓶加入含对照菌50100个菌落形成单位的控制菌菌液作阳性对照，第3瓶加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照n37培养1824h（必要时可延至48h）。阴性
14、对照应无菌生长。摇匀上述BL增菌培养液20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六2525中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室3.2 MUG试验原理n4-甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）试验的原理MUG被-葡糖苷酸酶（GUD）水解，产生荧光n实验证明96的大肠杆菌含GUD，约10的沙门菌属一些菌种也含有此酶。单一的MUG鉴别大肠杆菌其漏检率达6，鉴于98的大肠杆菌靛基质试验为阳性，故将MUG，靛基质试验结合，用EMB琼脂平板分离，辅以IMViC试验，在理论上可使大肠杆菌的检出率达99n由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大
15、肠杆菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测nMUG阳性（有荧光）、靛基质阳性（玫瑰红色）,MUG阴性（无荧光）、靛基质阴性（无色）n如MUG、I试验为阳性或阴性即可报告结果，如MUG与I试验不一致时，则需分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六2626中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室3.2 MUG试验操作n以灭菌吸管取供试品胆盐乳糖增菌培养液、供试品阳性对照培养液、阴性对照培养液各0.2ml，分别加入MUG蛋白胨培养基（培养基5.7）管，37培养4、24h后，将各管置366nm紫外灯下观察有无蓝白色荧光，然
16、后加欧波试液45滴于上述MUG管内，观察液面颜色20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六2727中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室3.2.1 MUG法不必分离单个菌落n除大肠埃希菌外，尚有部分志贺菌属、沙门菌属的菌株；以及少数革兰阳性球菌、杆菌和芽孢菌，其MUG为阳性n在MUG培养基成分中增加了去氧胆酸钠，可排除革兰阳性菌的干扰n志贺菌、沙门菌在胆盐乳糖培养基中较难生长，即使有生长，本法能检出。并且既然药品中不得检出大肠杆菌，更不允许检出志贺菌、沙门菌20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六2828中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室3.2.2 试验耗材要求n配制MUG培养基时，务必校正pH值，灭菌后pH不得过7.4，否则pH值偏高，MUG分解，本身则显荧光n分装MUG培养基的试管应挑选，试管、蛋白胨不得显荧光20052005年年4 4月月1616日星期六日星期六2929中国药品生物制品鉴定所抗生素室中国药品生物制品鉴定所抗生素室3.2.3 培养时间及干扰因素n供试品培养液接种于MUG培养基中的培养时间，一般
