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1、蛋白质样品制备技术蛋白质样品制备技术Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 蛋白质样品的制备是蛋白质组研究的第一蛋白质样品的制备是蛋白质组研究的第一步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，样步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，样品制备都是关键步骤。从蛋白质组大规模研究品制备都是关键步骤。从蛋白质组大规模研究的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有的的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有的蛋白质，但是由于蛋白质种类多、丰度不一和蛋白质，但是由于蛋白质种类多、丰度不一和物化特性多样等，要达到真正的全息制备是具物化特性多样等，
2、要达到真正的全息制备是具有难度的。有难度的。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 样品制备的原则样品制备的原则尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂以防止蛋白的降解。蛋白酶抑制剂以防止蛋白的降解。样品裂解液应该新鲜配置，并且分装冻存于样品裂解液应该新鲜配置，并且分装冻存于-80 -80 。勿反。勿反复冻融已制备好的样品。复冻融已制备好的样品。通过超速
3、离心清除所有的杂质。通过超速离心清除所有的杂质。加入尿素后加温不要超过加入尿素后加温不要超过37 37 ，防止氨甲酰化而修饰蛋白，防止氨甲酰化而修饰蛋白。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 一、样品的类型一、样品的类型 1. 1.整体样品整体样品 是生物个体小的物种（如微生物），可以整体是生物个体小的物种（如微生物），可以整体 取样。取样。 2. 2.组织样品组织样品 有一个采样的过程，就是从整体部分或整批器官有一个采样的过程，就是从整体部分或整批器官 中抽取一定量具有代表性的样品进行实验。中抽取一定量具有代表性的
4、样品进行实验。 3. 3.细胞样品细胞样品 包括固体基质中培养的细胞、体外悬浮培养生长包括固体基质中培养的细胞、体外悬浮培养生长 的细胞、周期性细胞样品（如红细胞、淋巴细的细胞、周期性细胞样品（如红细胞、淋巴细 胞）和从组织中分离同类的细胞样品。胞）和从组织中分离同类的细胞样品。 4. 4.可溶性样品可溶性样品 是可溶性液体样品，如血清、血浆、尿样、脑是可溶性液体样品，如血清、血浆、尿样、脑 脊液以及细胞和组织的水溶性提取物。脊液以及细胞和组织的水溶性提取物。第一节第一节 样品破碎与分离蛋白质样品破碎与分离蛋白质Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricul
5、tural University 二、组织与细胞破碎二、组织与细胞破碎 为了完全分析所有的细胞内蛋白，组织与细胞必须进为了完全分析所有的细胞内蛋白，组织与细胞必须进 行有效的破碎。破碎方法的选择依赖于样品来源（如细行有效的破碎。破碎方法的选择依赖于样品来源（如细 胞、固体组织或者其它的生物材料），同时也依赖于这种胞、固体组织或者其它的生物材料），同时也依赖于这种 分析是获得所有的蛋白质还是特殊的亚细胞器组分。分析是获得所有的蛋白质还是特殊的亚细胞器组分。 蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其会导致某些蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其会导致某些 蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋
6、白质蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋白质 样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。 Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University （一）（一）温和的裂解方法温和的裂解方法 通常应用于组分比较简单的样品，例如组织通常应用于组分比较简单的样品，例如组织 培养的细胞、血细胞和一些微生物，或者用于分培养的细胞、血细胞和一些微生物，或者用于分 析某一特定的细胞器，例如只需要裂解胞质蛋白、析某一特定的细胞器，例如只需要裂解胞质蛋白、 完整的线粒体或其它的细胞器。有时这些技术联合完整的线粒体或其它
7、的细胞器。有时这些技术联合 起来应用。起来应用。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 1. 1. 渗透裂解渗透裂解 非常温和的裂解方法，可进一步进行亚细胞分级非常温和的裂解方法，可进一步进行亚细胞分级 应用对象：应用对象： 血细胞、组织培养细胞。血细胞、组织培养细胞。 操作步骤：操作步骤： 将细胞悬浮于渗透胞溶液中，细胞溶将细胞悬浮于渗透胞溶液中，细胞溶 胀而释放出细胞内容物。胀而释放出细胞内容物。 Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 2
8、. 2. 冻融裂解冻融裂解 许多类型的细胞可以通过快速反复冻融得到裂解许多类型的细胞可以通过快速反复冻融得到裂解 应用对象：应用对象：细菌细胞、组织培养细胞。细菌细胞、组织培养细胞。 操作步骤：操作步骤：使用液氮，快速反复冻融至符合实验要使用液氮，快速反复冻融至符合实验要 求为止。求为止。 Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 3. 3. 裂解液裂解裂解液裂解 含有去污剂的裂解液处理细胞、组织以裂解细胞含有去污剂的裂解液处理细胞、组织以裂解细胞 膜，使细胞内容物释放出来。膜，使细胞内容物释放出来。 应用对象：应用对象
9、：组织培养细胞组织培养细胞 操作步骤：操作步骤：将细胞直接置裂解液或样品液中，进行将细胞直接置裂解液或样品液中，进行 悬浮处理。悬浮处理。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 4.4.酶裂解酶裂解 有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温 和裂解。和裂解。 应用对象：应用对象：植物细胞、细菌细胞、真菌细胞。植物细胞、细菌细胞、真菌细胞。 操作步骤：操作步骤：将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中。将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中。 Bioinformatics, 2010-201
10、1, Shanxi Agricultural University 二、剧烈的蛋白裂解二、剧烈的蛋白裂解 常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞，常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞， 或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞，这种方或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞，这种方 法可以使细胞完全破碎裂解。法可以使细胞完全破碎裂解。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 1. 1. 超声裂解法超声裂解法 超声仪可以产生超声波，通过切应力来裂解细超声仪可以产生超声波，通过切应力来裂解细 胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果。
11、胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果。 应用对象：应用对象：悬浮细胞悬浮细胞 操作步骤：操作步骤：要进行间歇处理，减轻产生热和泡沫，要进行间歇处理，减轻产生热和泡沫， 样品处理应在冰浴中进行。样品处理应在冰浴中进行。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 2.2.压力杯法压力杯法 在高压下迫使细胞穿过小孔径而在高压下迫使细胞穿过小孔径而 产生剪切力，从而裂解细胞。产生剪切力，从而裂解细胞。 应用对象：应用对象：微生物细胞，如细菌、微生物细胞，如细菌、 霉菌、酵母细胞及含有霉菌、酵母细胞及含有 细胞壁的细胞。细胞壁的细胞
12、。 操作步骤：操作步骤：将细胞悬浮液置于预冷将细胞悬浮液置于预冷 的压力杯中，施加压的压力杯中，施加压 力，然后收集挤出液。力，然后收集挤出液。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 3.3.研磨法研磨法 用研钵或研杵研磨细胞用研钵或研杵研磨细胞 应用对象：应用对象：固体组织细胞、微生物细胞。固体组织细胞、微生物细胞。 操作步骤：操作步骤：组织或细胞通常冻存于液氮中，随后研组织或细胞通常冻存于液氮中，随后研 磨成粉状，加氧化铝或砂有助于研磨。磨成粉状，加氧化铝或砂有助于研磨。Bioinformatics, 2010-2
13、011, Shanxi Agricultural University 4. 4. 机械匀浆法机械匀浆法 使用匀浆器破碎细胞或组织使用匀浆器破碎细胞或组织 应用对象：应用对象：固体组织，如心脏、肝固体组织，如心脏、肝 脏、肾脏组织和细胞悬脏、肾脏组织和细胞悬 液。液。 操作步骤：操作步骤：先尽量将组织剪成块，先尽量将组织剪成块， 然后加有蛋白酶抑制剂然后加有蛋白酶抑制剂 的冷匀浆液进行匀浆，的冷匀浆液进行匀浆， 过滤或离心收集。过滤或离心收集。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 5.5.玻璃珠匀浆法玻璃珠匀浆法 剧
14、烈震荡的玻璃珠打破细胞壁，释放细胞内容物剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁，释放细胞内容物 应用对象：应用对象：细胞悬液或微生物细胞悬液或微生物 操作步骤：操作步骤：用等体积的预冷裂解液重悬细胞，置用等体积的预冷裂解液重悬细胞，置 于结实的管子里。每克细胞（湿重）于结实的管子里。每克细胞（湿重） 加入加入1-31-3克玻璃珠，剧烈震荡克玻璃珠，剧烈震荡1min1min， 冰浴冰浴1min1min。重复上述步骤。重复上述步骤。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 三、用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解三、用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解 当
15、进行细胞裂解时，蛋白酶会释放出来，这会当进行细胞裂解时，蛋白酶会释放出来，这会严重影响电泳的结果，因此需要采取一些策略。严重影响电泳的结果，因此需要采取一些策略。如果可能的话，直接加入强变性剂。蛋白酶在低如果可能的话，直接加入强变性剂。蛋白酶在低温下无活性，因此尽可能在低温下进行样品制备温下无活性，因此尽可能在低温下进行样品制备。另外，许多组织蛋白酶在。另外，许多组织蛋白酶在PHPH超过超过9.09.0的时候会失的时候会失活，因此在样品裂解液中出现活，因此在样品裂解液中出现TrisTris、碳酸钠和载、碳酸钠和载体两性电解质时也可以抑制蛋白降解。虽然这些体两性电解质时也可以抑制蛋白降解。虽然这
16、些方法可防止蛋白降解，但是有些蛋白酶在上述条方法可防止蛋白降解，但是有些蛋白酶在上述条件下仍然保持降解蛋白的活性。此时，需要应用件下仍然保持降解蛋白的活性。此时，需要应用蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University PMSFPMSF( (苯甲基磺酰氟）苯甲基磺酰氟） 是一种不可逆抑制剂，通常浓度为是一种不可逆抑制剂，通常浓度为1mmol/L,1mmol/L,灭灭活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是其活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是其局限在于在水溶液中迅速失活，因此，现用现加局限在于在水溶液中迅速失活，因此，现用现加效果较好；另外，在二硫苏糖醇（效果较好；另外，在二硫苏糖醇（DTTDTT）或者）或者 - -巯巯基乙醇溶液中基乙醇溶液中PMSFPMSF的抑制效果可能会减小，因的抑制效果可能会减小，因此在含巯基的试剂中可在晚些时候加入。此在含巯基的试剂中可在晚些时候加入。 AEBSFAEBSF 为不可逆抑制剂，通常工作浓度为为不可逆抑制剂，通常工作浓度为4mmol/L4mmol/L，
