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1、PDX模型在卵巢癌研究中的应用进展在常见的妇科恶性肿瘤中,卵巢癌虽不是发病率最高的却是死亡率最高的疾病。临床上晚期卵巢癌标准治疗方案为“肿瘤细胞减灭术+铂类为基础的联合化疗”。近年来,卵巢癌手术技术得到了很大发展,但晚期卵巢癌手术残留病灶仍然无法避免,且成为卵巢癌复发的重要因素。综合来看,患者5年内的生存率仍为30%40%1。卵巢癌的化疗耐药是导致治疗失败的主要原因。因此对于晚期卵巢癌患者来说,如何解决化疗耐药性以延长患者无进展生存时间至关重要。妇科恶性肿瘤的临床前研究在很大程度上依赖于克隆的癌源细胞系和从这些细胞系中获得的肿瘤异种移植瘤,然而使用细胞系进行转化研究可能存在一定的缺点2,其中最
2、主要表现为,癌细胞株不可逆转地丧失了原始肿瘤重要的生物学特性,细胞株及其异种移植模型并不能准确地反应卵巢癌的原始表型及基因组特征3。人源性异种移植模型来源于未经培养的人类肿瘤,在保留细胞遗传学、细胞复杂性、血管和间质肿瘤结构的情况下2,更好地表现了妇科恶性肿瘤和人类肿瘤微环境的异质性。研究表明,有望通过这些模型分析出肿瘤的发生和发展过程,并用于测试药物疗效及预测临床结果。其价值可体现在包括靶向治疗在内的临床前药物筛选和生物标志物鉴定中,从而最终实现个体化治疗。1、卵巢PDX模型与传统细胞系来源的异体移植肿瘤模型1.1传统CDX模型传统的临床前卵巢癌动物模型多采用肿瘤细胞系模型建模法,它具有肿瘤
3、细胞系易获取及实验易重复等优点。模型中的细胞系是从患者的腹腔积液或胸腔积液中分离出的如SKOV3、A2780和OVCAR3等细胞株,经过细胞培养后注射到有免疫缺陷的小鼠体内。常用的宿主小鼠包括无胸腺裸鼠(Nude)、重症联合免疫缺陷小鼠和非肥胖糖尿病(non-obesediabetic,NOD)/SCID小鼠等4。然而许多人质疑这种模型能否真实准确地表达人类肿瘤所特有的性质,进而作为实验载体进行相关药物的测试与筛选。人类肿瘤难以治愈的重要原因是其异质性,这种异质性创造了一种复杂的微环境,使细胞生长在肿瘤的发展和转移等方面产生了差异5,6。而来自患者样本中培养出的细胞株经过多次传代培养,破坏了肿
4、瘤组织及细胞异质性与原结构,使细胞株显示出遗传和表型改变,造成表达谱与患者样本不同,从而使癌症的研究过于片面7。其次,体外细胞培养过程中缺乏存在于人类肿瘤中的基质和间充质元素,而这些元素是支持肿瘤增殖和转移及形成所需的旁分泌物和信号通路的重要组成部分8,9。因此导致了在肿瘤研究中,许多临床前的研究结果相较于实际临床治疗效果而言存在较大差异,对指导临床治疗的价值有限。1.2卵巢癌PDX模型卵巢癌PDX模型的构建:将手术切除的新鲜肿瘤组织,剔除其坏死和液化部分后,将剩余部分切成23mm3的组织块,通过皮下包埋、肾包膜下或原位种植到有免疫缺陷的小鼠体内进行培养,当肿瘤体积长到600800mm3时,剥
5、离肿瘤,并将其分成3份,第1份经10%甲醛溶液固定,石蜡包埋切片后进行HE或免疫组织化学染色,用来鉴定其组织学是否与原发肿瘤一致;第2份用于传代移植重新植入其他小鼠体内;第3份用来冻存以便后续提取DNA、RNA和蛋白质进行全基因组测序蛋白质表达等检测10。与传统肿瘤细胞系模型相比,PDX模型减少了体外处理步骤11,12,移植后的肿瘤细胞生长在了类似于患者原发肿瘤的部位(即卵巢),周围的营养和激素水平为肿瘤的生长提供了一种微环境,因而可保留供体肿瘤的大部分组织病理学、生物学和遗传学等关键特征,其次肿瘤组织来自不同患者,能够反映患者的遗传多样性13。与此同时PDX模型允许在连续几代小鼠中收获和重新
6、植入,作为每个患者的生物宿主,即使通过多次传代仍能保持生物学稳定性14,15,16。上述研究提示,PDX模型能够准确反映与人类卵巢癌发生和发展相关的细胞和分子变化,是一种较为理想的人肿瘤动物模型。2、卵巢癌PDX模型的研究进展及其应用2.1PDX模型的研究现状早期的一些研究者们利用黑素瘤、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、结直肠癌和脑癌成功的建立了相应的PDX模型17,但PDX模型用于卵巢癌上的研究在国内仍十分有限,目前仅限于模型建立与鉴定的初期阶段;国外的研究模型已经得到广泛应用并逐渐取代传统模型在临床前的试验。其中WEROHA等18成功建立了167个卵巢癌PDX模型,是目前较大规模且成功率较高的卵巢癌
7、PDX模型库,病理类型涵盖浆液性癌、透明细胞癌、黏液性癌及子宫内膜样癌等,其选择SCID小鼠作为移植动物,进行腹腔原位移植,成功率约可达71%。在此之前与人类相似的肿瘤生长、转移模式和腹腔积液的发展也在原位卵巢癌PDX模型中得到证实19。值得注意的是,尽管在这些卵巢癌PDX模型中小鼠基质替换为了人类基质,但连续移植6代后卵巢肿瘤组织学和癌基因表达仍保持不变20。在基因表达上,HUTCHINSON等21采用实时荧光定量PCR检测了患者和PDX模型中的84个肿瘤药物靶基因,发现其中有79个肿瘤药物靶基因具有相似表达(r2=0.7441)。这些研究结果表明,卵巢癌PDX模型可保持对应原代肿瘤的遗传特
8、性,即使经过传代培养其表达谱依旧稳定可以为后续实验研究提供可靠的基础。2.2PDX模型在化疗药物与靶向治疗上的应用2.2.1化疗药物抗癌药物开发的主要难题之一是新药成功率低,仅有5%的临床前抗癌药物最终被批准用于临床治疗20。这可能与筛选新药物使用的传统临床前模型的预测价值低有关。PDX模型作为一种潜在的实验动物模型其应用可能改变这一现状。KOIFSCHOTEN等22在一项研究中,将卵巢癌组织皮下移植到裸鼠体内建立卵巢癌PDX模型,进行化疗药物顺铂和环磷酰胺的药物反应测试,结果显示有40%的移植瘤模型对顺铂有药物反应,27%的移植瘤模型对环磷酰胺治疗有反应。由于PDX模型的潜在益处取决于它们能
9、否预测临床化疗反应,因此该研究将PDX模型对化疗的反应率与患者的化疗反应率进行了比较。其中患者对顺铂的应答率为48%,对环磷酰胺的应答率为40%,PDX模型对药物的反应率与相对应患者对药物的反应率大体相似;在类似的另一项研究中,PRESS等23在NOD小鼠的肾下囊中植入乳头状浆液性肿瘤和卵巢透明细胞癌,发现PDX模型与人类肿瘤具有相似的组织病理学和基因表达。当对这些PDX模型用卡铂和紫杉醇(paclitaxel,PTX)治疗时,肿瘤体积和有丝分裂指数Ki-67值显著降低。这些研究表明,在用一线化疗药物顺铂和PTX治疗移植瘤的反应很大程度上与治疗患者肿瘤的反应相似。RICCI等24通过给卵巢癌P
10、DX模型注射顺铂,建立了PDX耐药模型,利用该模型验证了PTX、贝伐单抗(bevacizumab,BEV)和丝裂原细胞外激酶(mitogenextracellularkinase,MEK)抑制剂药物的抗肿瘤疗效。实验结果显示,PTX/BEV/MEK组、PTX/BEV组、BEV/MEK组和PTX/MEK组的肿瘤增殖率(%)(T/C值)T/C=(治疗组肿瘤质量平均值/对照组肿瘤质量平均值)100%分别为0.7%、6.6%、16.2%和45.2%,这表明3种药物的联合应用优于2种药物的联合,对肿瘤的抑制作用更加明显,PDX模型可为二线抗肿瘤药物测试及新药的组合的重要工具。2.2.2靶向治疗晚期卵巢癌
11、具有高度异质性,转移性病变的数量和单位组织肿瘤细胞含量都不同于原发部位。目前,对于晚期卵巢癌患者的有效化疗和有针对性的治疗很少,晚期卵巢癌患者的5年生存率低于30%。靶向治疗是当前继手术、放疗和化疗后治疗恶性肿瘤的一种新方法,意义在于选择性地杀灭肿瘤细胞而不伤害正常组织25。在卵巢癌的靶向治疗中常用的靶向治疗药物有聚二磷酸腺苷核糖聚合酶抑制剂。目前美国食品药品管理局批准了3种PARP抑制剂:奥拉帕尼、瑞卡帕布和尼拉帕利用于卵巢癌的复发治疗26。PARP抑制剂的主要作用机制是阻断单链DNA的损伤修复,当PARP抑制剂参与的DNA单链损伤修复和同源重组修复均出现障碍时,可导致细胞优先死亡,即“合成
12、致死”作用26。在卵巢癌中,PARP抑制剂可以通过合成致死,诱导乳腺癌易感基因1/2缺陷,丧失同源重组功能的卵巢癌细胞发生凋亡27。KORTMANN等28将开发的BRCA2基因突变型浆液性卵巢癌PDX模型,随机分成奥拉帕尼、卡铂、奥拉帕尼+卡铂及空白对照组,经过4周的腹腔注射后,各组的肿瘤体积分别为:(19.725.0)mm3、(4.47.4)mm3、(1.21.4)mm3和(93.772.6)mm3;结果显示,3组给药方式均可抑制肿瘤的生长,其中以奥拉帕尼协同卡铂抑制肿瘤增长更加显著,并促进肿瘤细胞凋亡。可有效的提高患者PFS,具有良好的应用前景。PDX模型与患者对于药物治疗的反应有很大的相
13、似性,PDX模型就像是人体的一个镜像,可以精准的表现人体肿瘤的特性,进而代替患者成为判断如何进行药物治疗卵巢肿瘤的可靠模型,同时也可用于评估耐药机制、新药物组合及新疗法的临床前测试平台。2.3共临床试验(co-clinicaltrial)一旦药物进入临床试验阶段,就很难实时分析和整合临床前试验和患者之间的信息。这一方面是由于临床试验的内在性质,即患者一次只能接受一种药物或治疗方案,另一方面是由于缺乏足够多的实验对象,无法做到对临床观察进行更深入的研究29。因此,当患者出现特殊现药物反应时,通常很难详细研究其潜在机制。为此有研究者提出了“共临床试验”的概念。该试验是指临床前试验与临床试验同时进行
14、,对相关的临床、生物学和药理学信息进行全面分析。由于PDX模型不仅可以重现原发性癌症的遗传和异质性特征30,31,且其治疗反应与原发性患者的反应一致。因此,PDX模型可作为可靠的实验模型参与共临床试验。CAMPBELL32等在一项共临床试验中,对一位手术后的患者,进行丝裂原活化蛋白激酶激酶抑制剂曲美替尼治疗,该患者在为期2周的临床试验中出现了临床反应即肿瘤分期降级现象(从T3N1M0期下降到T1N0期),但患者后来发展为局部复发和肺转移。该患者的PDX模型则接受更长时间的MEK抑制剂曲美替尼的治疗,以确定该治疗方案是否具有临床效益。在PDX模型接受曲美替尼治疗的前50d内肿瘤体积减小,但50d
15、后肿瘤重新生长。因此,PDX模型显示的反应与患者的临床结果一致,表明这些模型可以作为供体患者的“镜像”模型。另一方面,PDX模型不仅可以与供体患者用同一种药物,也可以与其他药物或一种新的药物组合治疗。在这种情况下,PDX模型是一个“阿凡达”模型,其既可以预测一线化疗药物的抗药性发展,也可以预测在供体病人观察到耐药之前对二线化疗药物的反应33。2.4精准医疗随着生物信息学与基因组测序技术的发展,在大数据背景下对于肿瘤的治疗逐渐步入精确医疗的新时代。在这个时代,治疗和预防疾病要考虑到每个人在基因、环境和生活方式各方面的个体差异34。根据患者的特异性,以便在正确的时间给予正确的治疗。LI等35通过基
16、因测序结合肿瘤基因组图谱(TheCancerGenomeAtlas,TCGA)数据库和人蛋白图谱(TheHumanProteinAtlas,THPA),探索可能在化疗耐药过程中起关键作用的基因。研究者对卵巢癌PDX模型耐药组和药物敏感组进行全外显子测序和RNA测序,RNA序列分析显示有200个基因在耐药组中具有差异性表达,146个基因表达上调,54个基因表达下调。其中SAP25(基因和HLA-DPA1基因具有显著性差异,AKT3和PIK3R5基因参与了磷脂酰肌醇3-激酶蛋白激酶B(proteinkinaseB,PBK,又称AKT)信号通路。PI3K/AKT信号通路在调节细胞生长、细胞存活、血管生成、肿瘤发生和耐药等方面发挥着重要的调节作用,被广泛研究作为治疗靶点。全外显子序列分析表明,共鉴定出39个突变位点,仅发生在耐药组。4个基因在
