第29章 反转录病毒

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1、中国医科大学 尚红 第29章 反转录病毒 艾滋病概述 获得性免疫缺陷综合征，简称艾滋病（Acquired immunodefieiency syndrome，AIDS） 由一种名为“人类免疫缺陷病毒”（human immunodeficiency virus, HIV）所导致的疾病。 主要侵袭辅助淋巴细胞，破坏免疫系统，最终使患者免疫功能衰竭而死亡。 传染性强，死亡率高，号称“超级癌症”HIV的发现Montagnie (LAS) 1983. Science 220: 868-871Gallo (HTLV) 1983. Science 220: 865-86 Levy (ARV) 1984. S

2、cience 225: 840-8421986 国际病毒分类委员会： HIV HIV-2 1986 西非HIV的分型及其亚型 现有两型HIV：HIV-1和HIV-2， 种类HIV-1M（Major）组AD,FH,J,KO（Outlier）组ON（Non-M non-O）组NHIV-2A F 特点有相对优势亚型同一亚型差异很大亚型内的变异水平估算存在时间不同亚型传播途径和致病性不一不同亚型对抗-HIV药物引起耐药不同亚型重组HIV生物学特性 反转录病毒科，慢病毒属，人类免疫缺陷病毒组 根据病毒的生物学特性对HIV-1进行分群病毒与宿主细胞结合所利用的辅助受体的不同R5毒株(利用CCR5)X4毒株

3、(利用CXCR4)根据宿主范围非合胞体诱导株（NSI）合胞体诱导株（SI）复制特性不同毒力株快/高型无毒力株低/慢型HIV生物学特性结构 病毒呈球形，直径100120nm，电镜下可见一致密的圆锥状核心 核心： 2个逆转录酶 - 将RNA转录成DNA 蛋白酶 (p11) - 将大片断蛋白切小 整和酶 (p32) - 将HIV原病毒DNA插入宿主细胞DNA中 核心膜蛋白(p24, p17) 包膜： 脂质膜 - “借用”宿主细胞的细胞膜 gp120 - 病毒的膜蛋白，与被感染细胞CD4相结合部分 gp41 -病毒的膜蛋白，跨脂质膜的部分 HIV生物学特性基因结构 由两条单链RNA组成，每个基因组约为

4、9.7k，编码9个基因 RNA中含有3个结构基因gag、env 和pol，6种调控基因 tat, vif, vpr, vpx (vpu), nef, rev gag基因编码病毒的核心蛋白 pol基因编码病毒复制所需要的酶类（逆转录酶、整合酶和蛋白酶） env基因所编码病毒包膜蛋白，是HIV免疫学诊断的主要检测抗原 调控基因编码辅助蛋白，调节病毒蛋白合成和复制polgagenvvifLTRrevvpr tat vpurevtatnefLTRP55gp160P17P24P7 P6P10P66/51P15P32gp120gp41HIV生物学特性临床意义 HIV结构成分与病毒感染、临床诊断、药物、试剂

5、和疫苗研究密切相关 包膜糖蛋白是病毒进入细胞的门户 针对各种病毒抗原（gp120,gp41,gp24等）产生的抗体是临床诊断的重要物质基础HIV生物学特性对病程的影响 病毒与宿主之间的相互作用是决定病程进展的关键因素。 NSI型早期，进展慢，R5受体 SI型晚期，进展快，CXCR4受体HIV的感染性 对外界抵抗力较弱 对热、干燥敏感 60 60min, 80 30min，121 15min, 134 3min 不耐酸（PH6），稍耐碱（PH9） 对化学品敏感 0.5次氯酸钠、70%酒精、10%漂白粉、2%戊二醛、4%福尔马林等 对紫外线不敏感 注射器具、医疗用具通过高温消毒、煮沸或蒸汽消毒完全

6、可以达到消毒目的HIV传播途径 性途径 同性恋、异性恋、双性恋、共用性模拟器 血液途径 输血或血液制品、受精液或卵子、与他 人共用针具静(肌)注毒品、意外损伤后接触HIV感染性材料 母婴垂直传播 妊娠、生产、母乳喂养HIV致病机制高速复制 每天产生10-12亿个新病毒颗粒 HIV变异每天突变1万个 逆转录酶缺乏3-5外切核酸的校读功能，使RNA转录为DNA时经常出现错误。比真核细胞高100万倍。HIV致病机制进入易感细胞途径HIV-1通过gp120与靶细胞表面CD4分子和趋化因子受体结合HIV致病机制关于第二受体 与HIV有关的辅助受体有2类： CC型辅助受体：CCR1,CCR2b,CCR3.

7、CCR5 CXC型辅助受体：CXCR4 CCR5是最主要的第二受体，第二受体基因在不同人种中遗传的突变率有明显差异。缺乏第二受体表达的个体似乎对HIV-1有一定的抗性。HIV致病机制进入的其他方式 病毒细胞融合 NSI型与SI型 半乳糖苷神经酰胺（GalC)受体途径 MHC相关分子，淋巴细胞功能相关抗原1，Fc和补体受体介导途径。HIV致病机制复制周期 吸附和穿入 脱衣壳和逆转录 环化 整合 转录 翻译与装配 病毒体成熟出芽 HIV致病机制人体变化 体内播散期：2天达淋巴结，5天入血循环全身播散。 原发HIV感染期：一般24周 血清转换期 无症状感染期 艾滋病前期 艾滋病期 艾滋病晚期HIV致

8、病机制临床结局 典型进展者： 8-10年内，免疫功能逐渐下降。 快速进展者： CD4+细胞计数在2-5年内迅速下降 长期存活者：（长期不进展者） 维持健康状态12年以上，并且CD4+细胞计数维持正常。病毒载量低，NSI株，抗体不加重感染，I型细胞因子， CD8+细胞抗病毒反应很强。CD4+T细胞临床阶段A无症状或急性HIV感染或持续性全身淋巴结肿大B出现症状，不是A或CC艾滋病指针性症状500/ul（29%）A1B1C1200-499/ul（14-28%）A2B2C2200/ul（14%）A3B3C3 成人及青少年艾滋病分期标准（CDC，美国，1993年） CD4200/ul和/或出现艾滋病指

9、针性症状（如卡氏肺囊虫肺炎等）时，就可定义为进入艾滋病期。如表中A3，B3，C1-3期。HIV检测 直接检测病毒或其组成部分 检测人体HIV免疫反应HIV特异性抗体 从感染到血清抗体阳转有一段窗口期，平均为1-3个月，有一小部分HIV感染者出现延迟反应P24抗原测定适用范围：适用范围： HIV-1HIV-1抗体不确定或窗口期的辅助诊断抗体不确定或窗口期的辅助诊断 HIV-1HIV-1阳性母亲所生婴儿的鉴别诊断阳性母亲所生婴儿的鉴别诊断 第四代第四代HIV-1HIV-1抗原抗原/ /抗体抗体ELISAELISA试剂检测呈阳性反应试剂检测呈阳性反应， 但但HIV-1HIV-1抗体确认阴性者的诊断抗

10、体确认阴性者的诊断 监测病程进展和抗病毒治疗效果监测病程进展和抗病毒治疗效果P24抗原测定结果报告和解释 HIV-1 P24抗原的阳性结果必须经过中和试验确认 HIV-1 P24抗原阳性仅作为HIV感染的辅助诊断依据，不能依此确诊 HIV-1 P24抗原阴性结果只表示在本试验中无反应，不能排除HIV感染HIV核酸检测 窗口期辅助诊断窗口期辅助诊断 病程监控病程监控 指导治疗方案及疗效评价指导治疗方案及疗效评价 预测疾病进程预测疾病进程HIV核酸检测定性检测 用于HIV感染的辅助诊断。通常使用PCR或RT-PCR技术，使用分子生物学实验室通用的扩增试剂，引物可来自文献或自行设计，应尽量涵盖所有的

11、或常见的毒株，也可使用复合引物。 通常根据扩增产物的电泳图像判定结果，阳性结果还要进行核酸序列测定来确定。 HIV核酸检测阴性, 只可报告本次实验结果阴性，不可排除HIV感染。 HIV核酸检测阳性, 可作为诊断HIV感染的辅助指标，不单独用于HIV感染的诊断。 报告核酸定性检测结果时应注明反应条件和所使用的引物序列。HIV核酸检测定量检测 常用于监测HIV感染者的病程进展和抗病毒治疗效果。目前常用的方法有逆转录PCR实验（RT-PCR）、核酸序列扩增实验（NASBA）、分支DNA杂交实验（bDNA）等，这几种进口试剂盒的最低检测限为20-50拷贝/毫升 按照仪器读数报告结果，应注明使用的试验方

12、法、样品种类和样品量 测定结果小于最低检测限时，应注明最低检测限水平。注意低于最低检测限的结果不能排除HIV感染。 应附上仪器打印的数据HIV核酸检测样品的采集和处理 用于HIV核酸检测的样品有全血、血浆、组织和其他分泌物，有时还包括生物制品 采集样品应避免微生物和核酸污染。避免RNA酶造成的降解，采样后4-8小时内处理。处理后的样品应分装、标记，冻存于-20以下，RNA类样品冻存于 -80 应在2-8条件下运送。特殊情况下，可以用特快专递形式投寄，但必须将盛样品的试管包扎好，保证不会破碎和溢漏RocheBayer (前Chiron)Organon技术RT-PCRbDNANuclisens H

13、IV-1 QT结果比较约2xbDNA 2.0 2.0版结果约为RT-PCR的50%， 3.0版结果与Roche 基本相同与Roche 基本相同优点通过了 FDA认证假阳性结果较bDNA少1.5版对A-G亚型有较好的反应性操作时间较少对A-G亚型有较好的反应性通过了 FDA认证 可使用多种组织，如生殖道分泌液 对A-G亚型有较好的反应性检测范围大缺点操作容易污染测定范围较小（相对于NASBA）少数生物样品反应受抑制，如精液、乳汁和唾液早期版本对部分亚型反应性较差，1.0版对非B亚型的样品反应性普遍较差，（5）版通过改进对O亚型检测能力较差对低值样品检测的特异性较差。无内部质量控制，尤其在3.0版

14、中为单孔检测时，无法控制由于提取或加样操作的失误。不同版本间差异较大，2.0版约为RT-PCR50%，3.0版结果与Roche 基本相同表明两个版本间差异可能达到50%。对除血浆、血清外的大部分体液样品无法进行检测。对抗凝剂敏感，只能使用EDTA。早期版本（NASBA）对部分亚型（G亚型）反应性差。操作复杂，样品提取(不使用自动提取仪时)和测定反应时需要进行大量的手工操作。不适合一次大量检测，ECL读数仪每次只能进行12个样品的检测。实验内、外误差相对较大。检测范围标准版 (Amplicor 1.0 及 1.5)400 - 750,000 c/mL 超敏版 (Ultra-Direct 1.0

15、and 1.5):50-75,000 c/mLbDNA 3.0版:100-500,000 c/mLNuclisens HIV-1 QT: 40-10,000,000 c/mL (取决于样品量)HIV核酸检测定量检测方法的比较HIV核酸检测定量检测方法的选择 目前用于统一不同定量方法检测值的标准品尚未问世 不同定量方法结果之间还无法直接进行比较 建议同一患者治疗前后用同一方法进行HIV定量检测病毒分离培养 可用于HIV-1感染的辅助诊断及HIV-1抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助鉴别诊断 培养及分离HIV需要在特定的P3实验室进行，且HIV的分离率在30%-60%，这项试验仅用于HIV株的保存和科

16、学研究 HIV抗体诊断目前临床上实际应用的是测定特异性HIV抗体，包括初筛和确认实验。 HIV抗体诊断检测试剂 筛查试剂必须是HIV-1/2混合型、经国家药品监督管理局注册批准、批批检合格、临床评估质量优良、在有效期内的试剂。 目前常用的筛查试剂有酶联免疫(ELISA)、颗粒凝集和其他快速诊断试剂。采供血机构进行血液筛查应采用酶联免疫试剂。 自采自供血的单位必须进行HIV抗体检测，在尚未建立艾滋病筛查实验室的偏远地区可由经过培训的技术人员在规定的场所用快速试剂进行血液筛查。HIV抗体诊断ELISA方法 目前最常用的初筛实验 1985年第一代检测HIV-1抗体的试剂盒问市（全病毒抗原间接法） 目前采用第四代检测HIV-1抗体的试剂盒（以重组的多肽抗原和抗P24抗体包被的双抗原夹心法） 窗口期缩短了2-3周HIV抗体诊断四代试剂比较solidphasespecificdetection ofconjugate第一代病毒裂解液HIV-1IgG抗体HIV-1-IgG抗体第二代病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1/-2IgG抗体HIV-1/-2IgG抗体第三代病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1/-