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1、目录上一页下一页退出五、蛋白质的结构五、蛋白质的结构(一)、蛋白质分子的概念蛋白质分子：由一条或一条以上的多肽(polypeptide)链按各自特殊的方式组合而成的具有完整生物活性的蛋白质的最小单位。n蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。n蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。目录上一页下一页退出目录上一页下一页退出目录上一页下一页退出目录上一页下一页退出目录上一页下一页退出目录上一页下一页退出2.蛋白质一级结构的测定n蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结
2、构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。 目录上一页下一页退出基本要求：a、样品必需纯（97%以上）；b、知道蛋白质的分子量；c、知道蛋白质由几个亚基组成；（1）测定蛋白质一级结构的原则目录上一页下一页退出目录上一页下一页退出遵循原则：（1）提纯蛋白质样品。（2）测定NH2末端基的数目，由此确定蛋白质分子由几条链组成。（3）拆开二硫键，将蛋白质分子中的几条链拆开，并分离出每条肽链得到伸展的肽链。（4）肽链的一部分样品进行完全水解，测定其氨基酸组成，由此确定各种氨基酸成分的分子比（5）肽链的另一部分样品进行NH2和COOH末端基鉴定。（6）应用两种或两种以上不同的水解方法将所要测定的
3、蛋白质肽链断裂，各得到一系列大小不同的肽段。（7）分离提纯所产生的每个肽段，并测定其氨基酸顺序。（8）从有重叠结构的各个肽的氨基酸顺序中推断出蛋白质中全部氨基酸排列顺序。（1）测定蛋白质一级结构的原则目录上一页下一页退出（2）常用测定方法简介A.测定蛋白质分子中多肽链的数目。 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定目录上一页下一页退出（2）常用测定方法简介B.多肽链的拆分。 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定目录上一页下一页退出（2）常用测定方法简介B.多肽链的拆
4、分。 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定目录上一页下一页退出（2）常用测定方法简介C.二硫键的断裂二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇(还原法)处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定目录上一页下一页退出SSSSSS胰岛素HO-CH2-CH2-SHSHSHSH
5、SHSHSHSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HICH2COOHC.二二硫硫键键的的断断裂裂目录上一页下一页退出（2）常用测定方法简介C.二硫键的断裂二硫键的断裂n应用过甲酸氧化法拆分二硫键。蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定ssHcoooHSO3HSO3H目录上一页下一页退出（2）常用测定方法简介 D.分析多肽链的N-末端和C-末端。n多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。n在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定目录上一页下
6、一页退出nSanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。n在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。末端基氨基酸测定末端基氨基酸测定二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB）法法目录上一页下一页退出nEdman （苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行解离。苯异硫氰酸酯（Edman）法末端基氨基酸测定末端基氨基酸测定目录上一页下一页退出n在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以
7、与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。n此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。末端基氨基酸测定末端基氨基酸测定丹磺酰氯法丹磺酰氯法目录上一页下一页退出n此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。末端基氨基酸测定末端基氨基酸测定 肼解法肼解法目录上一页下一页退出n氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。n根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动
8、力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。n最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。末端基氨基酸测定末端基氨基酸测定氨肽酶氨肽酶( (amino peptidases)amino peptidases)法法目录上一页下一页退出n羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解AA。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。n目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。n羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-
9、末端残基的肽键。末端基氨基酸测定末端基氨基酸测定羧肽酶羧肽酶( (carboxypeptidase)carboxypeptidase)法法目录上一页下一页退出（2）常用测定方法简介E.多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定多肽链断裂法：酶解法和化学法目录上一页下一页退出 酶解法:n胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶多肽链的选择性降解多肽链的选择性降解目录上一页下一页退出nTrypsinase ：R1=Lys和Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。R2=Pro 水
10、解受抑。肽链水解位点胰蛋白酶-HN-CH-CO-NH-CH-CO-R1R2目录上一页下一页退出n或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=Phe, Trp,Tyr时水解快; R1= Leu，Met和His水解稍慢。nR2=Pro 水解受抑。肽链水解位点糜蛋白酶目录上一页下一页退出nPepsin：R1Phe, Trp, Tyr; Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。nR2=Pro 水解受抑。肽链水解位点胃蛋白酶目录上一页下一页退出nthermolysin：R2=Leu、Ile、Phe、Tyr、Val、Trp、Met 等疏水性强的氨基酸水解速度较快。nR2=Pro或Gly 水解受抑。n
11、R1或R3=Pro 水解受抑。肽链水解位点嗜热菌蛋白酶目录上一页下一页退出n谷氨酸蛋白酶： R1=Glu、Asp(磷酸缓冲液); R1=Glu (磷酸缓冲液或醋酸缓冲液)n精氨酸蛋白酶： R1=Arg肽链水解位点谷氨酸蛋白酶和精氨酸蛋白酶目录上一页下一页退出 化学法：可获得较大的肽段溴化氰(Cyanogen bromide)水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。多肽链的选择性降解多肽链的选择性降解目录上一页下一页退出 化学法：可获得较大的肽段羟胺（NH2OH）：专一性断裂-Asn-Gly-之间的肽键。也能部分裂解-Asn-Leu-之间的肽键以及-Asn-Ala-之间的肽键。多肽
12、链的选择性降解多肽链的选择性降解目录上一页下一页退出 胃蛋白酶：R1= Phe、Trp、Tyr或其它氨基酸 嗜热菌蛋白酶：R2=Leu、Ile、Phe、Tyr、 Val、Trp、Met 等 溴化氰法:R1= Met (化学方法)胰蛋白酶（胰梅）：R1= Lye&Arg糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）：R1= Phe、 Trp&Tyr 小结小结目录上一页下一页退出（2）常用测定方法简介F.分离肽段测定每个肽段的氨基酸顺序。蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定目录上一页下一页退出nEdman （苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸
13、残基逐一进行解离。EdmanEdman氨基酸顺序分析法氨基酸顺序分析法目录上一页下一页退出 测定每条多肽链的氨基酸组成蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定目录上一页下一页退出目录上一页下一页退出（2）常用测定方法简介G.确定肽段在多肽链中的次序。 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定目录上一页下一页退出 示例(十肽的水解)A法水解得到四个小肽： A1 Ala-Phe A2 Gly-Lys-Asn-Tyr A3 Arg-Tyr A4 His-ValB法水解得到四个小肽： B1 Ala-Phe-Gly-Lys B
14、2 Asn-Tyr-Arg B3 Tyr- His-Val目录上一页下一页退出目录上一页下一页退出 （三）蛋白质的空间结构1、概念 n蛋白质的空间结构（或构象、高级结构）：指蛋白质分子中原子或基团在空间的排列分布和肽链的走向。包括二、(超二级结构、结构域）三、四级结构 。 目录上一页下一页退出n构型（configuration）：指在立体异构体中取代原子或基团在空间的取向。两种构型间的转变需要共价键的断裂和重组。 COOH COOHH2N C H H C NH2 R Rn构象（conformation）:指取代原子或基团当单键旋转时可能形成的不同立体结构。这种空间位置的改变不涉及共价键的断裂。
15、概念目录上一页下一页退出肽键平面或酰胺平面：由于肽键中C-N具有部分双键的性质，不能旋转，使得肽键中的四个原子和与之相邻的两个-碳原子共处于一个平面，此平面就称为肽键平面或酰胺平面概念目录上一页下一页退出n蛋白质的构象：蛋白质分子中所有原子在三维空间的排列分布和肽链的走向。一个蛋白质的多肽链在生物体正常的温度和pH条件下，只有一种或很少几种构象。这种天然构象保证了它的生物学活性，并且相当稳定。概念目录上一页下一页退出蛋白质的构象 蛋白质多肽链空间折叠的限制因素：Pauling和Corey在利用X-射线衍射技术研究多肽链结构时发现： 1.肽键具有部分双键性质： 2.肽键不能自由旋转 3.组成肽键
16、的四个原子和与之相连的两个碳原子（C）都处于同一个平面内，此刚性结构的平面叫肽平面（peptide plane）或酰胺平面（amide plane）。 目录上一页下一页退出n定义：蛋白质的二级(Secondary)结构又叫主链构象，是指多肽链的主链本身（主链骨架）在空间的排列、旋转及折叠，并以氢键维系，而形成的有规则的构象。n它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。二级结构不涉及氨基酸残基的侧链构象。氢键是稳定二级结构的主要作用力。n主要有-螺旋、-折叠、-转角、自由回转。2 2、蛋白质的二级结构、蛋白质的二级结构目录上一页下一页退出.-螺旋结构及其特点n螺旋构象：指多肽链骨架围绕螺旋中心轴一圈一圈地上升而形成的螺旋式的空间结构。根据氢键形成的方式不同，可分为-系螺旋和-系螺旋两大类。n-螺旋是蛋白质中最常见，含量最丰富的二级结构。目录上一页下一页退出目录上一页下一页退出CNNC目录上一页下一页退出n多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离为0.15nm;n肽链内形成氢键，氢键的取向
