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1、内容提要 荧光分光光度术 荧光与荧光光谱 荧光分光光度术 荧光分光光度计与影响荧光测量的因素 应用 生物大分子的能量与能量转移 蛋白质与核酸的能量状态 生物大分子中的能量转移 单分子生物物理荧光分光光度术第一节 荧光与荧光光谱S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量 2 1 3 外转换 2T2内转换振动弛豫1、基态 一个分子在未吸收光能前所处的最低能量状态，叫基态。2、激发态 当吸收光能后分子就会使一个电子提高到高能量轨道，这种能量提高的状态叫做电子激发态，简称激发态。有最低的电子激发态叫第一激发态；有较高的电子激发态分别叫做第二、第三激发态等等。第二、第三激发态可将多余
2、能量以热能释放并降到第一激发态。一、荧光的产生3、单线态 当吸收光子处于激发态时，虽然能量提高了，但电子自旋方向并没有改变，这时的激发态仍然是单线态。4、三重态 指分子中电子自旋量子数S=1，即原来两个配对的自旋方向相反的电子之一自旋方向改变，以至电子自旋之和不为0的情况。激发态基态基态激发单重态激发三重态TST电子自旋状态一、荧光的产生 驰豫过程：吸收光能后分子处于激发态，处于激发态的分子可以通过多种途径，将多余的能量释放，使分子又回到稳定的基态，这些释放多余能量的过程就是驰豫过程。S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量 2 1 3 外转换 2T2内转换振动弛豫5、驰
3、豫过程一、荧光的产生 内转换：当两个电子能级非常靠近以至其振动能级有重叠时，如第一激发单重态的较高能级与第二激发态单重态的某一较低能级位能相同会发生电子由高电子能级以无辐射跃迁的方式跃迁至低能级上，称为内转换，转换速度10-1310-11 S（快）。S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量 2 1 3 外转换 2T2内转换振动弛豫5、驰豫过程一、荧光的产生 系间跨越：指激发单重态与三重态之间的无辐射跃迁，原因：激发态电子自旋反转，造成多重复改变，可能单重态（S1）低振动能级与三重态T1的较高振动能量有重叠。S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量 2
4、 1 3 外转换 2T2内转换振动弛豫5、驰豫过程一、荧光的产生 外转换（猝灭）：激发分子与溶剂分子或其它溶液分子相互作用，发生能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失现象称为猝灭。S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量 2 1 3 外转换 2T2内转换振动弛豫5、驰豫过程一、荧光的产生 荧光：处于电子激发态的分子回到基态时发射的光称为荧光。 磷光：某种物质被某种波长的光照射以后能在较长的时间内发生波长比荧光波长更长的光，则称这种光为磷光。S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量 2 1 3 外转换 2T2内转换振动弛豫5、驰豫过程一、荧光的产生n
5、荧光：处于电子激发态的分子回到基态时发射的光。 磷光：某种物质被某种波长的光照射以后能在较长的时间内发生波长比荧光波长更长的光。 荧光与磷光的产生过程：激发态基态的能量传递途径： 荧光：10-710-9 s，第一激发单重态的最低振动能级基态； 磷光：10-410s，第一激发三重态的最低振动能级基态；一、荧光的产生n 光谱红移：任一物质的荧光光谱及其峰位的波长总是比它的吸收光谱及峰位波长要长，这现象称为光谱红移。n 镜像规则：通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。 1、荧光光谱二、荧光光谱和吸收光谱2、荧光光谱与吸收光谱二、荧光光谱和吸收光谱n 镜像规则 基态上的各
6、振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。第二节 荧光分光光度术一、荧光分光光度术中的参量1、荧光强度（荧光强度（F F）其中，F：荧光强度， （1）：物质的发光本领， 0 ：荧光量子效率，Ia：吸收光强度。由Lambert-Beer定律：其中：I0为入射光强，I为透射光强。代入则有：当c很低时，当c很大时，1、荧光强度（荧光强度（F F）n 样品的浓度大，荧光就强（10-410-7mol/l）；n 浓度超过10-3mol/l后，浓度愈大荧光反而愈小（浓度猝灭现象）。一、荧光分光光度术中的参量一、荧光分光光度术中
7、的参量2、荧光光谱 荧光光谱包括激发谱和发射谱两种： 激发谱：表示某种荧光物质在不同波长的激发光作用下所测得的同一波长荧光强度的变化。以激发波长为横坐标，荧光强度为纵坐标画出的曲线即为荧光激发光谱，简称激光光谱。 激光谱说明哪种激发光波长荧光效率最高。激发光波长往往与该物质的吸收光谱中的峰位波长一致。200220240260280300320色氨酸的激发（）与吸收（-）nm一、荧光分光光度术中的参量2、荧光光谱 荧光光谱包括激发谱和发射谱两种： 发射谱: 是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。20026032038044050056
8、0620荧光激发光谱荧光发射光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱一、荧光分光光度术中的参量2、荧光光谱n 发射光谱的形状与激发波长无关：电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量（如能级图2 ，1），产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光（如2）。S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量 2 1 3 外转换 2T2内转换振动弛豫一、荧光分光光度术中的参量3、荧光偏振n 荧光偏振：荧光物质发出的荧光，其电场矢量方向介于自然光和偏振光之间，是部分偏振光。这一现象称为荧光偏振（又称荧光去偏振） 。自然光部分偏振光偏振光一
9、、荧光分光光度术中的参量3、荧光偏振n 荧光偏振其中：I 、 I 起偏器与检偏器光轴平行或垂直时测得的荧光强度。垂直激发光 检测器检测器II 起偏器 垂直激发光 检测器检测器I起偏器 I一、荧光分光光度术中的参量3、荧光偏振n 荧光偏振度（P）：荧光偏振的程度。其中： V（vertical）垂直，H（horizontal）水平。IVH，入射光偏振方向为垂直而发射光为水平时测得的荧光强度。一、荧光分光光度术中的参量3、荧光偏振n 荧光偏振度（P）的物理意义 时时，P=0，类类似自然光，荧光分子运动很快，取向随机。（稀溶液） 时时，P=1，平面偏振光，荧荧光分子运动动很慢，取向有序。 时时，0P1
10、，部分偏振光。生物大分子属于此种情况。一、荧光分光光度术中的参量4 4、荧光寿命、荧光寿命n 定义：荧光强度衰减到原来的1/e所需要的时间，称为荧光寿命（）。 其中，I0为激发时最大荧光强度，It为时间t时的荧光强度，k为衰减常数。荧光强度的衰减符合指数衰减的规律一、荧光分光光度术中的参量5 5、荧光探剂、荧光探剂 生物化学中主要的可分为两类。荧光生色团天然荧光生色团荧光指示剂（荧光探针）一、荧光分光光度术中的参量5 5、荧光探剂、荧光探剂n 荧光物质：通常都具有环状共轭双键（） 天然生物分子：的只有芳香族氨基酸、核黄素、维生素A、叶绿素和NADH等少数分子。 蛋白质：只有含苯丙氨酸、酪氨酸和
11、色氨酸时才具有荧光特性。 核酸：除碱基外也不发荧光。 脂质（脂组成的膜系统）：无荧光特性。一、荧光分光光度术中的参量5 5、荧光探剂、荧光探剂n n 天然荧光生色团结构特点天然荧光生色团结构特点 碳原子骨架 分子具有共轭双键体系，大多含有芳香环或杂环 任何有利于提高电子共轭度的结构改变，都将提高荧光效率。如：对苯基化，间苯基化等。一、荧光分光光度术中的参量5 5、荧光探剂、荧光探剂n n 天然荧光生色团结构特点天然荧光生色团结构特点 分子的几何排布 具有刚性平面结构 荧光素COOCOOHHO酚酞CHOCOOHHOH一、荧光分光光度术中的参量5 5、荧光探剂、荧光探剂n n 天然荧光生色团结构特
12、点天然荧光生色团结构特点 取代基的类型 加强荧光的基团：给电子取代基，如，-NH2、 -NHR、 -OH、-OR、 -CN、-OCH3、-OC2H5 减弱荧光的基团：得电子取代基，如，-CO2H、-COOH、-C=O、-NO2、-NO、-SH、-F、-Cl、-Br、-I 影响不明显的基团：-R、-SO3H、-NH3一、荧光分光光度术中的参量5 5、荧光探剂、荧光探剂n n 天然荧光生色团结构特点天然荧光生色团结构特点 取代基的位置 邻位、对位荧光增强 间位荧光减弱（-CN基例外）一、荧光分光光度术中的参量5 5、荧光探剂、荧光探剂色氨酸Tryptophan（W，Trp）CH2CHCOO-+NH
13、3N酪氨酸Tyrosine（Y, Tyr）CH2CHCOO-HO+NH3n n 蛋白质和核酸中的荧光生色团蛋白质和核酸中的荧光生色团苯丙氨酸Phenylalanine(F, Phe)CH2CHCOO-+NH3一、荧光分光光度术中的参量5 5、荧光探剂、荧光探剂n 荧光探剂（针） 荧光探剂（针）：根据小的荧光分子性质的改变，分析大分子的结构，这类小分子称为。 荧光标记：利用荧光探剂标记到无荧光的分子或系统内，以研究后者的特性，这种方法称为荧光标记。一、荧光分光光度术中的参量5 5、荧光探剂、荧光探剂n n 荧光探剂（针）分子的基本要求荧光探剂（针）分子的基本要求 能产生稳定、较强的荧光； 探针与
14、被研究分子的某一微区必须有特异性的结合，而且结合得比较牢固； 探针的荧光必须对环境条件比较敏感； 结合的探针不应影响被研究的大分子的结构和特性。一、荧光分光光度术中的参量5 5、荧光探剂、荧光探剂n n 荧光探剂（针）的应用分类荧光探剂（针）的应用分类 测定细胞活性的荧光探针：活细胞探针和死细胞探针。 膜荧光探针：荧光基团标记的磷脂，阴离子膜探针，阳离子膜探针，其它非极性和双亲性膜探针。 细胞器荧光探针：线粒体探针，溶酶体、酵母菌液泡和其它酸性细胞器的探针 。 离子荧光探针：Ca2、 Mg2、Zn2 、Na、 K， Cl-等。一、荧光分光光度术中的参量5 5、荧光探剂、荧光探剂n n 荧光探剂
15、（针）的应用分类荧光探剂（针）的应用分类 pH荧光探针：近中性pH应用的探针、酸性、探针交联物。 活性氧和一氧化氮探针 细胞骨架蛋白荧光探针 信号转导探针：蛋白激酶，蛋白磷酸酶和核苷酸结合蛋白探针 入胞作用、受体和离子通道探针 细胞形态和流体测量的荧光示踪剂第三节 荧光分光光度计及影 响荧光测量的因素 入射的激发光与荧光探测方向垂直，可避免入射光的干扰，也有采用90o以外方向夹角。UV-VIS 光源90o单光束荧光仪的仪器结构框图检 测 器发射波长 选择器样 品 室激发光波长选择器 输出和控制装置一、荧光分光光度计仪器结构UV-VIS 光源90o检 测 器发射波长 选择器样 品 室激发光波长选
16、择器 输出和控制装置一、荧光分光光度计仪器结构n n 光源：光源：氙灯（200800nm）、高压汞灯、一些频率可调的激光器n n 波长选择器波长选择器：常采用光栅或滤光片作为波长选择器件n n 样品池：样品池：用去除荧光物质的石英玻璃制成的矩形或正方形杯，四面透明n n 检测器：检测器： 200600nm光电倍增管，也有对红光比较敏感的光电倍增管。1 1、结构、结构 荧光测量样品可以是液态、固态或凝聚态。一、荧光分光光度计仪器结构2 2、样品、样品n 液体样品采用普通的样品杯和样品架，测量时采用透射模式；n 固体样品需要采用固体样品架，测量时的几何配置模式不仅不是透射模式，还要避免入射光直接通过样品反射进入监测器；n 凝胶态样品，可以根据样品的透明程度决定采用液体样品架或固体样品架。二、影响荧光测量的因素1 1、光化分解、光化分解n n 物质吸收光能后，会使化学键断裂，从而产生光化分解，导致荧光减弱。n 保存在棕色瓶中，样品光照后，立即进行测量。二、影响荧光测量的因素 荧光测量样品可以是液态、固态或凝聚态。2 2、淬熄（淬灭）、淬熄（淬灭）n 温度淬灭：温度升高，分子运动加速，分子间的
