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1、病毒大量制备和CsCl梯度离心纯化:1. 将293细胞铺于30-40个10cm dish ,至细胞长满,每块板加入合适 滴度的病毒(约107-10 8 pfu/ml ) 10此 感染细胞,待细胞全部病变后(4-7 天),每块板中加入约 500 口(150ul ) 10% Nonidet P 40(NP40)以裂解细胞。收集整个细胞裂解物,如果不是立即做CsCl纯化的话,可放在-80 C冰箱。2. 12,000 rpm 离心10 min ,弃细胞碎片,收集上清。每 100ml上清加 入 50 ml PEG8000 (20% PEG8000 , 2.5M NaCl ),冰上 1 hr 沉淀病毒。3
2、. 12,000 rpm 离心上述混合物20 min ,弃上清,将沉淀物悬浮在 10 ml 密度为 1.10g/ml 的 CsCl 溶液中(溶剂为 20 mM Tris-Hcl ,pH 8.0 )04oC 7,000 rpm离心5 min ,收集病毒悬浮液。4. CsCl梯度的制备,用滴管轻轻加入 2.0 ml的CsCl (密度1.40g/ml , 溶剂同上)。再加入3.0 ml密度为1.30 g/ml 的CsCl溶液。再加入5 ml的 病毒悬浮液。20,000 rpm ,室温离心2 hr。收集密度在1.30-1.40g/ml 之间 的病毒条带至透析袋中,透析袋用前用10 mM 的EDTA Na2煮沸10 min 。在透析缓冲液(将50g蔗糖,10ml 1M pH为8.0的Tris-HCl液,2ml 1M MgCl 2溶液定容至1,000 ml)中,4oC透析过夜,中间换一次透析液。收集 病毒,测定病毒滴度。三种密度的 CsCl溶液配制(溶于灭菌20 mM Tris中, pH8.0), 4 c保存。密度(g/ml)(20 c)浓度(W/V)CsCl 量(g)终体积(ml)1 . 4056%7.84101 . 3031%4.03101 . 1012%1.3210欢迎下载,谢谢观看!资料仅供参考学习