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1、马铃薯X病毒研究进展摘 要：从PVX的发生与分布、基因组结构与功能、检测方法、防治技术和应用研究方面进行了综述，同时对PVX的应用前景进行了展望，旨在为PVX的深入研究提供参考。 关键词：马铃薯X病毒；分布与发生；基因结构与功能；检测方法；防治技术 马铃薯X病毒（Potato virus X，PVX）又称马铃薯潜隐病毒（Potato latent virus）或马铃薯轻花叶病毒（Potato mild mosaic virus），为马铃薯X病毒属（Potexvirus）模式成员，是由一条正链RNA组成的线性病毒，RNA长约6.4 kbp，病毒粒子呈长杆状，长宽=515 nm13 nm。自然条件
2、下主要靠寄主植株不同部位、寄主植株之间接触摩擦进行机械传播。PVX单独侵染时症状较轻，与马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）、烟草脉斑驳病毒（Tobacco vein mottling virus，TVMV）、烟草蚀纹病毒（Tobacco etch virus，TEV）等马铃薯Y病毒属病毒复合侵染时症状加剧，造成严重经济损失13。目前有关PVX的分布与发生、基因组结构和功能、检测方法、防控技术以及生产应用等方面的研究均取得显著进展。本文对上述研究进展进行了综述，探讨其中尚存在的问题，以期为深入开展PVX相关研究提供一定参考。 1 PVX的发生与分布 所有马铃薯（Solanum
3、tuberosum）产区均存在PVX发生的现象，但不同栽培品种受PVX侵染情况存在较大差异，有些品种带毒率较高。在田间，PVX侵染马铃薯植株，引起轻型花叶或者潜隐病征，若多年侵染则易引起重花叶或者植株矮化，造成10%80%减产。PVX常与PVY复合侵染，使症状加剧46。PVX主要靠汁液接触传播，也可以由某些昆虫如异黑蝗（Melanoplus differentialis）和绿丛螽斯（Tettigonia viridissima）的咀嚼式口器经机械作用传播，菟丝子（Cuscuta campestris）和集合油壶菌（Synchytium endobiotcum）也能够传播该病毒，但实生种子不能传
4、毒7。PVX 寄主范围较广，可侵染16科240种植物，茄科植物是主要的寄主，其诊断寄主有白肋烟（White burley）及其他烟草（Nicotiana tabacum）品种。初侵染的叶片通常表现为坏死斑，之后发展为坏死斑驳、褪绿、花叶或脉褪绿。在曼陀罗（Datura stramonium）上继斑驳之后产生褪绿环，脉褪绿或脉坏死。烟草栽培品种适于作繁殖寄主。千日红（Gomphrena globosa）是较好的指示植物，除HB株系外都产生局部斑8，9。 对于PVX株系的分类还未有统一的标准，但Cockerham10的方法认可度较高，该方法根据PVX侵染携带不同抗病基因（Nx和Nb）的马铃薯植株所
5、表现出的症状，将PVX株系分为4组，分别是X1、X2、X3和X4。X1组（如CS35株系）在含Nx、Nb基因的马铃薯上均能引起过敏反应（Hypersensitive resistance，HR）。X2组（如CP株系）只在含Nb基因的马铃薯上引起HR。X3组（如UK3、DX株系）只在含有Nx基因的马铃薯上引起HR。X4组（如DX4、CP4、HB株系）则能完全克服Nx、Nb抗性。许多研究表明，PVX的外壳蛋白（Coat protein，CP）基因在决定PVX与植物抗病基因互作方面起着重要作用。CP可作为激发子使马铃薯产生HR、ER（极端抗病性，extreme resistance，ER）反应，CP
6、基因核苷酸序列的变化会导致寄主产生不同的症状类型。因此，PVX的CP基因序列分析也有助于对PVX的分类研究1116。 2 PVX的基因组结构与功能 PVX基因组由一条单组分的正单链RNA分子组成，长度约6.4 kbp。RNA的5-末端有m7GpppA帽子结构，3-末端有1个poly（A）尾结构，共包含5个开放式阅读框（Open reading frane，ORF）。ORF1编码166 kDa的RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp），是PVX合成RNA必需的，也是唯一来源于自身的蛋白。中间的ORF2、ORF3、ORF4相互重叠，被称为三基因
7、区段（Triple-gene block，TGB），分别编码25 kDa的TGBp1蛋白、12 kDa的TGBp2蛋白、8 kDa的TGBp3蛋白，这些蛋白与病毒在寄主细胞间的移动有关，其中，TGBp1蛋白已经被证明是一种转录后基因沉默的抑制因子，可打破寄主植物的防御反应，使病毒成功侵染。3-末端的ORF5编码25 kDa的病毒外壳蛋白（Capsid protein，CP），除具有包装核酸的功能外，也是病毒在细胞间移动所必需的，而且还能起到复制调节的作用1719。 另外，PVX基因组还包括5-末端非翻译区域（5-Untranslational region，5-UTR）和3-端非翻译区域（3-
8、Untranslational region，3-UTR）。5-UTR有84个核苷酸（nt），已有的研究表明，5-UTR对于病毒的复制、细胞与细胞间的移动以及病毒的组装等有重要作用2023。3-UTR有72个核苷酸，含有多种重叠的作用元件，其中包括1个富含U的八核苷酸序列，对于病毒RNA与寄主蛋白之间的互作以及病毒的增殖起着重要作用24。 3 PVX的检测方法 PVX的检测方法较多，主要包括指示植物检测法、电镜检测法、免疫学检测法和核酸介导的分子生物学检测法。 3.1 指示植物检测法 指示植物检测法是利用指示植物被PVX侵染后所表现出的特异症状，来检测PVX是否存在。指示植物检测法简便可行，对
9、仪器设备要求较低，可迅速掌握利用。吴凌娟等9用多种指示植物分离鉴定了PVX，结果发现千日红发病时间短、易观察，比较适合作为PVX检测的指示植物。常用于检测PVX的指示植物还包括白花刺果曼陀罗（Datura metel）、心叶烟（Nicotiana glutinosa）等。但指示植物检测法耗时较长，受环境影响较大，准确性和灵敏度不高，已不作为PVX检测和鉴定的主要方法，多用于分子生物学或免疫学检测之前的初步鉴定25。 3.2 电镜检测法 电镜检测法是开展植物病毒研究的常规手段之一，主要是通过观察病毒粒子形态、内含物、亚结构等方面的特征来确定病毒的种类。电镜的分辨率可达到0.5 nm，比指示植物法
10、更直观、速度更快、观察结果也更准确。张仲凯等26，27利用电镜对云南地区的PVX等病毒进行了观察和鉴定。电镜还可以观测到病毒引起的寄主细胞的病变和内含体特征，是深度研究病毒病机理的重要手段。但是，电镜检测法所需仪器设备昂贵，操作过程繁琐，对人员要求较高，在PVX检测上应用较少。 3.3 免疫学检测法 酶联免疫吸附法 酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）由Voller等28首次应用于植物病毒检测，主要是利用抗原与酶标抗体特异性结合以及底物的显色反应，检测病毒存在与否，并可对病毒含量进行初步测定。ELISA具有简便、快速、准确、灵敏度高等
11、优点，适合于口岸、生产企业开展大样本检测。ELISA依据支持物的不同可分为双抗体夹心法（DAS-ELISA）和硝酸纤维素膜法（NCM-ELISA）。DAS-ELISA和NCM-ELISA在PVX检测上应用较为广泛。李云海等29利用ELISA对云南省马铃薯脱毒试管苗的PVX病毒进行了检测；白艳菊等30利用DAS-ELISA对黑龙江省主栽马铃薯品种的脱毒试管苗及田间收获薯块感染PVX的情况进行了检测；仲乃琴31利用DAS-ELISA对甘肃省种植的6个马铃薯品种的老龄薯、幼龄薯以及2个品种的茎尖组培苗携带PVX的情况进行了检测分析；张国柱32利用NCM-ELISA对山西省的主栽马铃薯品种PVX感染情
12、况进行了检测，并均取得了较好的结果。 免疫胶体金技术 免疫胶体金技术（Immune colloidal gold technique，ICG）是一种新型检测技术，该技术操作简单，样品用量较少、无需特殊处理，检测时间短，仅15 min便可完成，肉眼水平便可观察结果，特别适合口岸检疫、基层单位的实验室和大田病毒病害的快速检测33，34。魏梅生等35已研制出用于PVX检测的ICG试纸条，该试纸条的灵敏度和精确度均较高。张丽等36利用ICG技术对宁夏地区不同马铃薯品种及不同级别脱毒种薯的脱毒情况进行了检测，发现ICG检测效果与ELISA相当，但具有样本用量极小、操作简单等优点，适用于一级种薯田间小样本
13、抽样检测。 3.4 分子生物学检测法 分子生物学方法在马铃薯病毒检测中的应用发展十分迅速。与传统马铃薯病毒检测方法相比，其具有灵敏度高、特异性好等优点，尤其是反转录-聚合酶链式反应（Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）和核酸斑点杂交（Nucleic acid spot hybridization，NASH）技术已经被广泛应用于PVX的检测。 RT-PCR技术 RT-PCR技术以PVX的RNA为模板，通过反转录合成cDNA，然后对cDNA扩增，最后进行检测分析，该方法具有操作简单、灵敏度高、快速、特异性强、重复性好和取样量
14、少等优点，十分适合种薯生产企业的质控管理37。关翠萍 等38运用一步RT-PCR法对马铃薯中的PVX等病毒进行了检测，建立了灵敏度较高的一步法RT-PCR检测技术。朱云芬等2建立了PVX的RT-PCR和 IC-RT-PCR（Immunocapture reverse transcription polymerase chain reaction）技术，认为这2种方法均具有较高的灵敏度，均可满足检测需求。在RT-PCR技术的基础上，研究者们进一步开发了多重RT-PCR技术，可对PVX等多种马铃薯病毒同时进行有效的检测3941。 NASH技术 NASH技术是将PVX基因组的一段核苷酸序列进行放射性
15、或非放射性标记，制成探针，再与待检样品的核酸进行杂交，从而指示PVX的存在与否42。Eweida等43利用NASH检测PVX，结果表明该方法的灵敏度是ELISA的100250倍。Katarzyna等44利用NASH对马铃薯组培苗中的PVX等病毒进行了多重检测。吴兴泉等45首次在国内研究建立了PVX的NASH检测技术，认为NASH可完全满足检测的实际要求。 4 PVX的防治技术 PVX的防治技术主要包括生产脱毒种薯、培育抗病毒品种和利用抗病毒化学药剂3个方面。生产脱毒种薯是目前最主要的防控措施，培育抗病品种是今后的发展方向，研发有效的抗病毒化学药剂也是一个重点领域。 4.1 脱毒种薯生产 脱除P
16、VX的常用方法有热处理脱毒法、茎尖培养脱毒法、热处理结合茎尖培养脱毒法，其中热处理结合茎尖培养脱毒法应用最为广泛，脱毒效果也最显著46，47。PVX脱毒种薯的生产流程主要分为4步，第一步是在实验室利用上述脱毒方法去除PVX，得到马铃薯组培脱毒试管苗；第二步是在温室或者网室内开展微型薯（也称作原原种，薯块质量120 g）的生产；第三步是在田间开展原种（薯块质量小于 75 g）的生产；第四步是在田间开展一级种（也称作生产种，薯块质量50100 g）的生产。在脱毒种薯的生产过程中，必须对各级种薯携带PVX的情况进行检测，严格控制种薯带毒率。 4.2 抗病品种培育 常规育种技术是马铃薯抗病毒病育种的主要途径之一，主要是通过杂交等方法，将抗性栽培种、野生种或近缘种的抗病基因引入到主栽品种 中48，49。目前，研究者们已经分离了多个抗PVX的基因。Ritter等50分离定位了PVX的极端抗性基因Rx1和Rx2，并
