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1、 细 胞 （组 织）化 学 技 术发展史：细胞化学是研究细胞显微结构和超微结构的化学组成及其定位的科学（定量）。研究对象是生物大分子：核酸、蛋白质、酶、多糖、脂类等在细胞或组织内的结构、分布及变化，为深入阐明细胞和异常细胞的增值与分化、遗传与发生、病理和病因等提供科学依据。1830年比利时植物学家Raspail发表论文在生理学重视用显微镜观察生化物质。1830-1870组织化学主要用于揭示生物界中的生理现象。1880-1920随着显微镜的改进和组织细胞学染色技术的发展，组织化学的概念从生理组织学转变为显微化学。1900-1935年细胞化学技术在病理学染色方法中的应用，丰富了显微镜下证实核酸、蛋
2、白质、酶、多糖、脂类等物质的组织化学内容。以后发展了酶细胞化学。20世纪50年代，电子显微镜的问世，观察细胞的超微结构。到80年代末，发展与完善了电镜细胞化学。70年代由于细胞显微分光光度法和荧光显微光度法的建立，使细胞化学的成分得以定量、形成定量细胞化学。80-90年代，流式细胞仪可对单细胞化学成分定量分析的新技术（每秒可测上万个信息）。80年代后期，创立了激光扫描共聚焦显微技术，对单个细胞进行CT分析，通过计算机进行三微立体旋转，从各角度分析细胞深层和细胞表面的各种结构。可研究活细胞和定量分析细胞内的遗传物质DNA、RNA、细胞器、酶的含量等。五色素形成法显示酶定位的方法某化学物质在酶作用
3、下在细胞局部形成色素沉淀，包括四唑盐法、联苯胺色素法、黑色素形成法等。其中四唑盐法用于定性各种氧化还原酶、多种脱氢酶、转移酶等。还有脱氢酶显示法、底物标记法、荧光染色与免疫荧光法、酶标抗体法等。具体几项细胞化学技术简介：（一）。孚尔更反应显示DNA方法(Feulgen)用弱酸（!NHCL）水解析饱和中DNA，打开嘌呤硷基和脱氧核糖核酸连接的双链，释放出醛基，与Schiff试剂结合紫红色化合物。用显微分光光度计定量分析。（二）。甲绿派郎宁显示DNA和RNA甲绿染DNA，派郎宁染RNA，它们并不是化学作用，而是与两种核酸的聚合程度有关。结果细胞核的DNA绿色兰绿色，核仁和胞质的RNA呈红色。（三）
4、。丫叮橙（AO）荧光染色显示DNA和RNAAO荧光染料与多聚体的DNA和RNA具有亲和力。结果细胞核的DNA亮绿色黄绿色荧光，核仁和胞质的RNA呈红色荧光。（四）。多糖的显示法过碘酸雪夫（Schiff）氏剂反应多糖（糖原）+过碘酸醛基+Schiff氏剂紫红色化合物（五）。酶的显示1碱性磷酸酶的显示（钙-钴法）用磷酸脂为底物，被碱性磷酸酶水解后释放出磷酸基，在pH9。29。8条件下，磷酸基与钙形成磷酸钙（无色）+硝酸钴磷酸钴（无色）+黄色硫化胺硫化胺钴（黑色）结果碱性磷酸酶成浅灰、灰黄、灰黑色。色深者表示酶多。对照组无反应。2三磷酸腺苷酶（ATPase）ATP酶使ATPADP,释放磷酸基+硝酸铅
5、磷酸铅（黑色）结果ATP酶呈棕黑色沉淀，色深者表示酶多。对照组无反应。3葡萄糖-6-磷酸酶显示法（G-6-Pase）葡萄糖-6-磷酸酶作用葡萄糖-6-磷酸酶钠（钾）释放磷酸基+硝酸铅磷酸铅（黑色）结果G-6-P酶呈棕黑色沉淀，色深者表示酶多。对照组无反应。 ATPaseATPase ATPase G-6-Pase G-6-Pase G-6-Pase G-6-Pase 45-核苷酸酶的显示法（5-Nucleoyidase）此酶作用于5-核苷酸、水解嘌呤核苷酸或嘧啶核苷酸第五位碳原子的磷酸分子，释放磷酸基+硝酸铅磷酸铅（黑色）。结果5-核苷酸酶呈棕黑色沉淀，色深者表示酶多。对照组无反应。免疫细胞化
6、学术 应用抗原与抗体结合的免疫学原理，检测细胞内的多肽、蛋白质及膜抗原和受体等大分子物质的存在与分布。其特点是特异性强、敏感性高、进展迅速，应用广泛。程序： 1 抗原（提取动物某些肽类或蛋白质）注入另一动物体内产生抗体（Ig）血清分离提取抗体 2 抗体标记抗体+荧光素（异硫氰酸荧光素）与相应抗原结合呈黄绿色荧光抗体+辣根过氧化物酶（HRP）与相应抗原结合呈棕红色荧光方法：（1）直接法抗原抗体直接结合简便、迅速，但是敏感性较低。（2）间接法 一抗体（作为抗原）注入物体内产生第二抗体常用过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法（PAP法）。较复杂，敏感性高（3）新进展亲合素（卵白素）生物素法（LAB法）桥连
7、亲合素（卵白素）生物素法（BAB法）亲合素生物素过氧化物酶复合物法（ABC法）(市场商品)组织培养术:体外研究活细胞或组织的有价值的手段无菌条件下，取活组织、活细胞（或传代培养的细胞株）培养液（天然或人工合成），在一定温度、O2、CO2、Ph培养（加某种受试因素）倒置显微镜下观察：细胞活组织的增殖、分化、运动、吞噬等。可连续录像观察。 正常培养细胞 中药组细胞 西药组细胞 对照组细胞 中药组细胞 原位杂交术:即核酸分子杂交组织化学术。基本原理：两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA双链分子的特点，应用带有标记的（有放射性同位素，如3
8、H、35S、32P、荧光素、生物素、地高辛等放射性物质）DNA或RNA片段作为核酸探针，与组织切片或细胞内待测核酸（RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示。在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在与定位。用此技术可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。此方法有极高的敏感性和特异性，可进一步从分子水平探讨细胞的功能表达及其调控机制，已成为当今细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。放射自显影术: 是通过活细胞对放射性物质的特异性摄入，以显示该细胞的功能状态、或该物质在组织或细胞内的代谢过程。将放射性同位素或放射性同位素标记的物质注入体内，间隔一定时间后取材、制备
9、切片，并在其上面涂以感光材料（感光乳胶或贴以照相底片），置暗处暴光，再显影、定影。结果，在放射性同位素或其标记物存在的部位，溴化银被还原为黑色的微细颗粒，可在光镜或电镜下观察，从而获知被检物质在组织或细胞内的分布及相对含量。在注入同位素标记物后，如果有规律地在若干时间段取材，则可以观察到被检物质的动态分布及变化过程，如将131I注入体内可以观察碘在甲状腺滤泡内的代谢情况；将3H标记的胸腺嘧啶核苷注入体内，就能研究蛋白质或核酸在组织、细胞内的代谢过程。组织工程:是用细胞培养术在体外模拟构建机体组织或器官的技术。组织工程主要包括以下四方面：获取生长旺盛的细胞,即种子细胞。准备细胞外基质，包括生物材
10、料(如牛胶原)及无毒、可被机体吸收的人工合成高分子材料。构建组织或器官，即有目的地把种子细胞置于细胞外基质中进行三维培养，并形成所需要的形状。将构建物移植机体。目前正在研究构建的组织器官主要有皮肤、软骨、骨、肌腱、骨骼肌、血管及角膜等；其中以组织工程皮肤较为成功并已应用于临床治疗烧伤、皮肤静脉性溃疡等疾病。软骨组织工程研究进展实验中的组织工程“耳” CaoYL，etal:Transplantationofchondrocytesutilizingapolymer-cellconstructtoproducetissueengineeredcartilageintheshapeofahumane
11、ar PlasticReconstrSurg,1977,100:297 实验中的组织工程“耳”制备程序1、将人的耳廓印下来，制成石膏软件。2、生物材料（聚乙醇酸）形成耳廓模型。3、取小牛关节软骨细胞，加入到耳廓模型 中，体外细胞培养 (1周）。4、将耳模型植入到裸鼠背部。5、4周后生长形成与人耳外形相同的“人耳”。5形态计量术形态计量术是研究组织和细胞内各种有形成分的数量、体积、表面积等项的绝对或相对值的方法。研究机体某些结构的立体数值的科学，称为体视学数值以“量”的概念进一步阐述了结构与功能关系及其病理状态下发生的变化。目前常用的精密定量方法有以下几种：（1）显微分光光度术显微分光光度术是显
12、微镜技术与分光光度技术的结合，可测出细胞内各种化学成分的含量，如测定蛋白质、酶、脂类、糖及DNA与RNA等含量。（2）显微荧光光度术显微荧光光度术是利用对细胞内原有发荧光的物质，或对细胞内各种化学成分用不同荧光素标记后，进行定性、定位和定量的测量。（3）流式细胞术流式细胞术是一种对流体单个细胞及其它生物微粒进行快速定量分析与分选技术。同时可测量一个细胞8个相关参数，测速可达5000个细胞/秒，分选纯度可高达99%以上。（4）图像分析术图像分析术是把计算机、电视和数字图像处理等结合在一起的一种新技术，可快速准确地测量组织切片或电镜照片中的微细结构，通过软件程序获得各项数据。也可测量组织化学染色切片，根据染色深浅而提供该物质含量的相对数值。还可以根据连续的组织切片应用计算机进行三维重建，该仪器使用面广泛，所得数据迅速、准确。避免人为因素。小结:简述细胞化学的原理及常用的几种方法?名词解释:PAS反应组织培养术流式细胞术组织工程原位杂交形态计量术图像分析术 谢 谢！
