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1、 DNA重组技术概述 DNA重组技术前言一、重组DNA技术的诞生（一）重组DNA技术诞生的理论基础 1.40年代明确了遗传的物质基础是DNA 肺炎链球菌2 2、5050年代揭示了年代揭示了DNADNA分子的双螺旋结构模分子的双螺旋结构模型和半保留复制型和半保留复制3、50年代末和60年代提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码。中心法则遗传密码遗传密码 64 64个密码子个密码子 61 61个代表各种氨基酸（个代表各种氨基酸（AUGAUG起始密码）起始密码） 3 3个密码子为终止子（个密码子为终止子（UAAUAA、UAGUAG、UGAUGA）操纵子 用基因表达调控的原理解释了酶诱
2、导的本质。（二）关键性实验技术问世为重组DNA技术奠定基础 1.DNA分子的切割与连接技术 2.载体构建和大肠杆菌转化体系的建立 3.Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链式反应二.重组DNA技术的定义及步骤（一）重组DNA技术1、重组DNA技术（recombinant DNA technology): 按照人的意愿，在体外对DNA分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝，表达相关基因的产物，是进行基因功能研究的基本方法。2.2.克隆（克隆（clone):clone):指由一个细胞通过无性繁殖以后形成的与亲代指由一个细胞通过无性繁殖以
3、后形成的与亲代完全相同的子代群体。完全相同的子代群体。分子克隆（分子克隆（molecular cloningmolecular cloning）：）： 构建构建DNADNA重组体并导入宿主细胞建立无重组体并导入宿主细胞建立无 性繁殖体系。性繁殖体系。（二）重组DNA技术的重大意义 1.填平了生物种属间不可逾越的鸿沟。 2.缩短了进化时间。 3.使人能对生物体进行定向构造。三、工具酶（一）限制性核酸内切酶是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶。2.命名第一个字母（大写、斜体） 该酶的微生物属名第二、三个字母（小写、斜体） 代表微生物种名第四个字母（斜体） 代表寄主菌的株或型用
4、罗马数码I、II、III等区分同一株具 有不同特异性的酶例 流感嗜血杆菌中三个酶的命名：Haemophilus influenzae d 属名 种名 株系 H in d I II III Hind I Hind II Hind III 2.分类 根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为： I型 II型 III型（1）I型限制酶属于复合功能酶，兼有修饰和切割DNA两种特性。 功能功能 核酸内切酶核酸内切酶甲基化酶甲基化酶ATPATP酶酶DNADNA解旋酶解旋酶 特点：特点： 识别和切割位点不一致识别和切割位点不一致 没有固定的切割位点没有固定的切割位点 随机切割随机切割 不产
5、生特异片段不产生特异片段 （2）III型酶与I型酶特性类似，也有甲基化功能，但无ATP酶和DNA解旋酶活力。在DNA链上有特异位点切割，其切割位点在识别位点以外。（3）II型酶3. II型酶（1）II型酶的识别 识别序列一般为4-6个碱基对，通常是反转重复顺序，具有180的旋转对称性。（2）II型酶的切割功能平末端（blunt end) 在识别顺序的对称轴上，对双链DNA同时切割。5端粘性末端（cohesive end) 在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的5末端切割。 3端粘性末端 在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的3末端切割。（3）少数有特殊性质的II型酶异源同工酶（
6、isoschizomer） 定义： 来源不同但能识别和切割同一位点的酶。 5 5 C C C G G C G G 33 3 G G C 3 G G C C C 55 5 5 C C C G G C G G 33 3 G G C 3 G G C C C 5 5HpaHpaIIII、MspMspI I同尾酶（isocaudarner) 为识别与切割顺序相互有关的酶。 有些限制酶的识别序列包含在另一些限制酶的识别顺序之中 酶来源不同，但它们作用后能产生相同的粘性末端。5 5 G G G A T C C G A T C C 333 C C T A G 3 C C T A G G G 555 5 A A
7、 G A T C C G A T C C 333 C C T A G 3 C C T A G A A 55BamH IBamH IBag IIBag II55 G G G A T CG A T C C C 333 C3 C C T A GC T A G G G 55特点：两个同尾酶消化的DNA片段，可以相互连接，连接后的重组DNA分子，可以被其中一种酶识别，也可能原来的任何一个同尾酶均不能识别。5.限制性内切酶的星号活力（1）定义：限制性内切酶在非标准反应条件下，能够切割一些与其特异识别顺序类似的序列，这种现象称星号活力。（2）表示：在相应限制酶的名称，右上角加一个星号（*）。（3）特点：星号
8、活力的识别形式常对标准识别顺序中两侧的碱基没有特异性。GACTAGCGACTAGCN NAATTAATTN NTACGCTACGCAATTAATTT TCTGATCGCTGATCGN NTTAATTAAN NATGCGATGCGTTAATTAAA A EcoEcoRI*RI*EcoRI*EcoRI*（4）产生的原因 a.高甘油含量（5%V/V) b.内切酶用量过大，一般为100U/g DNA c.低离子强度25mmol/L d.高pH值 pH8.0 e.含有机溶剂：DMSO、乙醇、乙烯二乙醇 Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的离子存在 （5）常见容量发生星号活力的酶有：Eco
9、RI、HindIII、KpnI、PstI、ScaI、SalI、XmnI、HinfI、BssHII、EcoRV7.II型限制酶的用途（1）DNA重组克隆及亚克隆（2）DNA杂交与序列分析（3）改建质粒（4）构建基因组DNA物理图谱和文库等 （二）DNA聚合酶1、大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段（Klenow片段）（1）大肠杆菌DNA聚合酶I 特性：具有3种酶活性5 35 3外切功能外切功能 3 5 3 5 外切功能外切功能 聚合酶功能聚合酶功能5 5 CCGCCG3 GGCTATCGA53 GGCTATCGA5聚合酶聚合酶dATPdATPdTTPdTTPdGTPdGTPdCTPdCTP5 5 C
10、CGCCGATAGCTATAGCT333 GGCTATCGA53 GGCTATCGA5a.5a.53DNA3DNA聚合酶活性聚合酶活性 底物：单链底物：单链DNADNA模板及带模板及带33羟基的羟基的DNADNA引物引物5 5 CCG3CCG33 GGC53 GGC5聚合酶聚合酶5 5 CCGCCGATAGCTATAGCT333 GGC53 GGC5A T A G C TA T A G C T b.3b.355外切酶活性外切酶活性 底物：底物：带带33羟基的双链羟基的双链DNADNA或单链或单链DNADNA、从从33羟基端降解羟基端降解DNADNA。对双链对双链DNADNA链的外切核酸酶活性可
11、被链的外切核酸酶活性可被5533DNADNA聚合酶活性所封闭。聚合酶活性所封闭。c. 53外切酶活性： 能从游离的5末端降解DNA成为单核苷酸。5 5 CCGCCGATAGCTATAGCT333 GGCTATCGA3 GGCTATCGAATAT55聚合酶聚合酶5 5 CCGCCGATAGCTATAGCT333 GGCTATCGA53 GGCTATCGA5T TA ATATA（2）Klenow片段 从大肠杆菌DNA聚合酶I中去除53外切酶活性，即得Klenow片段。 其只具有 53聚合酶活性 35外切酶活性 35kD76kD苦草杆菌蛋白酶裂解全酶5 3外切酶5 3聚合酶 3 5外切酶5 3聚合酶
12、 3 5外切酶Klenow片段DNA聚合酶I全酶应用1.催化DNA切口平移反应，置备高比活DNA探针。(大肠杆菌DNA聚合酶I）DNaseIDNaseIDNADNA聚合酶聚合酶I IdNTPdNTP3232P-dNTPP-dNTP2.对DNA分子进行末端标记（Klenow）2 .Taq DNA聚合酶(1)特性： 耐热的DNA聚合酶来自于嗜热的栖热水生菌Thermus aquaticus 中纯化而来的。 53聚合酶活性 53外切酶活性 最佳作用温度为75-80C （2 2）用途）用途通过通过PCRPCR对对DNADNA分子的特定序列进行体外扩增分子的特定序列进行体外扩增 对对DNADNA进行测序
13、进行测序 3.反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶，RDDP）（1）特性催化从RNA为模板的DNA聚合反应 具35RNA外切酶活性，能特异性降解RNA DNA杂交分子中的RNA部分 具DNA指导的DNA聚合酶（DDDP）的功能 能以mRNA为模板催化合成出互补的DNA（cDNA） （2）分类 禽源反转录酶 来自禽或骨髓细胞瘤病毒（AMV） 具有聚合酶活性及强的RNA酶H活性 无35外切酶活性。 温度42C pH8.6时活性较高 鼠源反转录酶 来自Moloney鼠白血病病毒（M-MLV）具有聚合酶活性及相对较弱的RNA酶H活性 无35外切酶活性 温度37C pH7.6时活性较高 4.末端脱氧核糖
14、核酸转移酶（末端转移酶） 催化dNTP加到DNA分子的3羟基端33末端标记末端标记添加多聚体尾添加多聚体尾（三）DNA连接酶1.定义：DNA Ligases are primarily responsible for joining the gaps that form in DNA during replication(i.e., the joining of Okazaki fragments formed by discontinuous or lagging strand replication), DNA repair, and recombination. 催化双链DNA一端的3O
15、H与另一双链DNA5的磷酸根形成3，5-磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平末端的DNA末端连接起来。3.3.特点：特点： 催化催化DNA 5DNA 5磷酸基与磷酸基与33羟基之间（切口羟基之间（切口）形成磷酸二酯键。）形成磷酸二酯键。切口切口( (nick)nick)：DNADNA分子糖分子糖- -磷酸主键的破坏。磷酸主键的破坏。缺口缺口( (gap)gap)：DNADNA分子中核苷酸缺失。分子中核苷酸缺失。2.2.分类：分类： T T4 4噬菌体噬菌体DNADNA连接酶连接酶 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA连接酶连接酶 4.用途：连接带匹配粘端的DNA分子。使平端的双链DNA分子互相连接或与合
16、成 接头相连接。5.反应例解：（1）互补粘端DNA(或切口间的连接) 5 ACGOH pAATTCGT 3 3 TGCTTAAp HOGCA 5 ATP、Mg2+ T4连接酶 5 ACGAATTCGT 3 3 TGCTTAAGCA 5（2）平端连接5 C G AOG pC G T A 33 G C Tp OHG C A T 5 ATP、Mg2+ T4连接酶 5 CGACGTA 3 3 GCTGCAT 5（四）T4多核苷酸激酶T4 polynucleotide kinase (T4 PNK) 催化将ATP的-磷酸转移到DNA链的5末端1.1.反应分类反应分类（1 1）前向反应）前向反应 将将ATPATP的的 - -磷酸转移到脱磷酸的磷酸转移到脱磷酸的DNADNA链的链的55末端末端（2）交换反应过量的ADP使T4多核苷酸激酶将5-末端磷酸从磷酸化的DNA链中转移到ADP上生成ATP，然后再从 -32PdATP上将标记的磷酸转移到DNA链上，使其重新磷酸化。用途标记DNA链的5末端连接反应（五）碱性磷酸酶alkaline phosphatase (CIAP)1.特性： 催化去除DNA、RN
