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1、第三节第三节 基因工程制药生产的基本过程基因工程制药生产的基本过程一、工具酶的分离纯化一、工具酶的分离纯化二、载体的分离纯化二、载体的分离纯化三、外源三、外源DNADNA和目的基因的分离和获得和目的基因的分离和获得四、外源四、外源DNADNA与载体与载体DNADNA的切割与连接的切割与连接五、宿主细胞的选择和基因导入操作五、宿主细胞的选择和基因导入操作六、基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点六、基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点七、基因工程菌中试七、基因工程菌中试八、基因工程菌的扩增和发酵生产八、基因工程菌的扩增和发酵生产九、基因工程药物的分离和纯化技术九、基因工程药物的分离和纯化技术十、变性蛋
2、白的复性十、变性蛋白的复性十一、基因工程药物的质量控制十一、基因工程药物的质量控制十二、基因工程药物的制造实例十二、基因工程药物的制造实例血红蛋白基因血红蛋白基因排列顺序血红蛋白的结构血红蛋白的运送氧气功能血红蛋白的基因工程流程血红蛋白的基因工程流程一、工具酶的分离纯化一、工具酶的分离纯化（一）基因工程制药所用到的工具酶（一）基因工程制药所用到的工具酶（二）关于限制酶（二）关于限制酶（三）关于连接酶（三）关于连接酶（二）关于限制酶（二）关于限制酶1 1、宿主限制现象、宿主限制现象2 2、限制酶的定义、限制酶的定义3 3、限制酶的特征、限制酶的特征4 4、限制酶的作用、限制酶的作用5 5、基因工
3、程所用到的限制酶、基因工程所用到的限制酶6 6、影响限制酶作用的因素、影响限制酶作用的因素1、宿主限制现象 病毒或噬菌体在宿主A细胞中生长良好,但在宿主B细胞中生长很差,原因是它的DNA受到宿主B的限制,这种现象是宿主控制性限制 （restriction）与修饰(modification) ,简称（R/M体系）。n细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。n nR/MR/M体系：体系：是由两种酶活性配合完成的：是由两种酶活性配合完成的：n n一种是修饰的甲基转移酶一种是修饰的甲基转移酶n n另一种是核酸内切限制酶另一种是核酸内切限制酶E.coliBE.
4、coliB含有含有EcoBEcoB核酸酶和核酸酶和EcoBEcoB甲基化酶甲基化酶当当(k)(k)噬菌体侵染噬菌体侵染E.coliBE.coliB时，由于其时，由于其DNADNA中有中有EcoBEcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而而E.coliBE.coliB的的DNADNA中虽然也存在这种特异序列，中虽然也存在这种特异序列，但可在但可在EcoBEcoB甲基化酶的作用下，催化甲基化酶的作用下，催化S-S-腺苷甲腺苷甲硫氨酸（硫氨酸（SAMSAM）将甲基转移给限制酶识别序列）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。的特定碱基，使之甲基化。
5、EcoB(EcoB(大肠杆菌大肠杆菌B B株株) )的核酸酶不能识别已甲基化的核酸酶不能识别已甲基化 的序列。的序列。n n R/MR/M体系的作用：体系的作用：n n保护自身的保护自身的DNADNA不受限制；不受限制；n n破坏外源破坏外源DNADNA使之迅速降解使之迅速降解TGAN8TGCT ACTN8ACGA TGAN8TGCT ACTN8ACGA ECOB核酸酶甲基化酶CH3CH3CH3CH3噬菌体来源序列宿主来源序列限制性内切酶本是微生物细胞中用于限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源的一类酶，其功专门水解外源的一类酶，其功能是避免外源的干扰或噬菌体能是避免外源的干扰或噬菌体的
6、感染，是细胞中的一种防御机制。的感染，是细胞中的一种防御机制。由于由于R/MR/M现象的发现使得核酸内切酶现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。成为基因工程重要的工具酶。2、限制酶的定义 凡是能够识别和切割DNA分子内特定核苷酸顺序的酶称为限制酶。限制酶分为三个类型：（1）型限制酶-由于其切点不固定，很难形成特异性的切割末端。（2）型限制酶-是位点特异性酶，是基因工程理想的工具酶。（3）型限制酶-对DNA的识别与切割点不同，不产生特异性DNA片段。3 3、限制酶的特征、限制酶的特征 具有专一性的识具有专一性的识别位点。别位点。 能够形成固定的能够形成固定的核苷酸单链末端核苷酸单链末
7、端。 比较适合于进行比较适合于进行DNADNA结构的分析和结构的分析和进行基因重组。进行基因重组。4 4、限制酶的作用、限制酶的作用（1 1）进行）进行DNADNA重组。重组。（2 2）构建新载体。）构建新载体。（3 3）构建基因文库。）构建基因文库。（4 4）进行）进行DNADNA序列分析。序列分析。（5 5）制备）制备DNADNA放射性探针。放射性探针。5 5、基因工程所用到的限制酶、基因工程所用到的限制酶通常是通常是型限制酶型限制酶，具体有以下几种。，具体有以下几种。EcoR-IEcoR-IHind-IIIHind-IIIBamH-IBamH-IPst-IPst-I Sst-I Sst-
8、ISal-ISal-IAva-IAva-I Bcl-IBcl-IHind-IIHind-IIHpa-IHpa-I Bgl-II Bgl-II Cla-I Cla-IHae-IIIHae-IIIHha-IHha-IHinf-IHinf-IHpa-IIHpa-IIMbo-IMbo-ISma-ISma-IXba-IXba-I Xho-IXho-I6、影响限制酶作用的因素（1）DNA的纯度（2）DNA的甲基化程度（3）DNA的结构（4）反应的温度-最适温度为37度（5）反应的缓冲体系-反应体系中通常含有MgCl2、NaCl、KCl、-巯基乙醇、二硫苏糖醇、牛血清白蛋白。它们具有激活酶、稳定酶的作用。（
9、三）关于连接酶（三）关于连接酶1 1、定义、定义-凡是能够催化凡是能够催化DNADNA片段片段5 5 - -末端的磷酰基末端的磷酰基与与3 3 - -末末端的羟基端的羟基结合成结合成磷酸二酯键磷酸二酯键的酶，称为连接酶。的酶，称为连接酶。2 2、作用、作用-主要用于主要用于（1 1）正常）正常DNADNA的合成。的合成。（2 2）损伤）损伤DNADNA的修复。的修复。3 3、种类、种类（1 1）DNA-DNA-连接酶连接酶-广泛存在于生物细胞之中，主要取广泛存在于生物细胞之中，主要取自于大肠杆菌自于大肠杆菌E.coliE.coli。（2 2）T4-DNAT4-DNA连接酶连接酶-来自于经过来自
10、于经过T4-T4-噬菌体感染的大肠噬菌体感染的大肠杆菌杆菌E.coliE.coli。 （3 T4-RNA3 T4-RNA连接酶连接酶-催化单链催化单链DNADNA或或RNARNA的的5 5 磷酸与另一磷酸与另一单链单链DNADNA或或RNARNA的的3 3 羟基之间形成共价连接。羟基之间形成共价连接。二、基因工程载体的分离纯化二、基因工程载体的分离纯化（一）定义（一）定义（二）基因工程载体的必备条件（二）基因工程载体的必备条件（三）基因工程载体的种类（三）基因工程载体的种类（一）定义（一）定义 能够将目的能够将目的基因基因携带携带进进宿主细胞、宿主细胞、并可使得目并可使得目的基因能够的基因能够
11、在宿主体内在宿主体内进行进行自主性自主性复制复制的遗传的遗传因子，称为因子，称为基因工程载基因工程载体。体。（二）基因工程载体的必备条件 （1）具有有效运载能力。（2）载体自身能够独立复制，并且在宿主体内进 行自主性复制。（3）载体在携带目的基因之后，还能够在宿主体内进行自主性复制。（4）在宿主体内，能够控制外源基因的表达活动。（5）能够携带大小不同的外源性目的基因。（6）鉴定方便、装卸技术简单。（7）容易控制、安全可靠。 （8）应具有灵活的克隆位点、并且有方便的筛选标记。（9）应具有很强的启动子。（10）应具有阻遏子，使启动子受到控制，因为外源基因的高效表达会抑制宿主细胞的生长、增殖，而阻遏
12、子可使宿主细胞免受这种影响。（11）应具有很强的终止子，以便重点克隆外源基因区段，而不转录其它无关基因。（12）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即含有起始密码AUG和SD序列，以便转录之后能够顺利于进行翻译。（三）基因工程载体的种类（三）基因工程载体的种类1 1、细菌质粒、细菌质粒2 2、真核基因病毒、真核基因病毒DNADNA3 3、噬菌体噬菌体DNADNA4 4、单链、单链DNADNA噬菌体噬菌体M13M13载体载体5 5、人工质粒载体、人工质粒载体-科斯质粒科斯质粒6 6、酵母酵母人工染色体人工染色体7 7、其他载体、其他载体1、细菌质粒（1）质粒的定义（2）质粒的特性（3）质粒的
13、分类（4）质粒载体的具备条件（5）常用的细菌质粒（1）质粒的定义 存在于天然细菌体存在于天然细菌体内的一种独立于细内的一种独立于细菌染色体之外的菌染色体之外的双双链环状链环状DNADNA，具有，具有独独立复制立复制的能力，常的能力，常带有细菌的带有细菌的抗药基抗药基因因。也存在于某些。也存在于某些真核细胞（真核细胞（酵母的酵母的22环状质粒环状质粒）质粒载体(plasmid)（2）质粒的特性 独立于细菌染色体之外的环状DNA或RNA。 其遗传特性属于非染色体控制。 能够进行自我复制。 容易在宿主体内进行转移和迁移。 可编码宿主染色体所不具有的基因。能够赋予宿主额外的遗传特性：A、编码产生抗生素
14、酶的抗性基因，B、编码产生糖酵解酶系的基因，C、编码产生抗重金属酶的抗性基因。质粒的复制类型严谨型（strigent plasmid)：复制与宿主染色体同步受宿主染色体复制的限制，在宿主细胞中拷贝数低约份拷贝。松弛型（relaxed plasmid):复制不受宿主染色体复制的限制可独立复制，在宿主细胞中拷贝数高，宿主细胞中质粒有10-200拷贝。基因工程常用载体。质粒质粒DNADNA的构型的构型 三种不同的构型：三种不同的构型： 当其两条核苷酸链均保持着完整的环形结构时，当其两条核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称为称为共价闭合环形共价闭合环形DNA(cccDNA)DNA(cccDNA)，这样
15、的，这样的DNADNA通常通常呈现超螺旋的呈现超螺旋的SCSC构型；构型； 如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为为开环开环DNA(ocDNA)DNA(ocDNA)； 若质粒若质粒DNADNA的双链均发生断裂而形成线形分子，的双链均发生断裂而形成线形分子，则通称为则通称为L L构型构型。 单链切割连接单链切割连接共价闭合环形DNA（SC型）开环DNA（oc型）线性DNA（L型）环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型（3 3）质粒的分类）质粒的分类 F F质粒质粒
16、-可使宿主可使宿主A A的部分基因随着的部分基因随着F F质粒一起质粒一起转移到不存在该质粒的另一宿主转移到不存在该质粒的另一宿主B B的体内。的体内。 R R质粒质粒-可编码可编码宿主宿主A A的一种或者数种抗生素的一种或者数种抗生素抗性基因，并能够将它们抗性基因，并能够将它们带到带到不存在该质粒的不存在该质粒的另一另一宿主宿主B B的体内，使得宿主的体内，使得宿主B B也获得同样的抗也获得同样的抗性。性。 ColCol质粒质粒-能编码能编码大肠杆菌毒素基因大肠杆菌毒素基因，通过表，通过表达之后产生的大肠杆菌毒素可以使得不带达之后产生的大肠杆菌毒素可以使得不带ColCol质质粒的其它菌株死亡。粒的其它菌株死亡。（4）质粒载体具备条件 质粒载体，也称质粒克隆载体，是指用于实现基因工程操作的质粒。必须具备以下条件：（1）其分子结构中必须具有多个单一限制酶的切割位点。（2）构建重组质粒之后必须具有转化功能。（3）分子量较小，易于操作。（4）宿主范围较为单一、无感染性。（5 5）常用的细菌质粒）常用的细菌质粒pBR322pBR322pBH10pBH10pBH20pBH20pTR262pTR2
