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1、紫外可见吸光光度分析方法、应用、软件1. 紫外可见吸光光度分析方法2. 紫外可见吸光光度分析方法的应用举例3. Win-sp分光光度计工作站功能4. Win-sp分光光度计工作站使用指导紫外可见吸光光度分析方法、应用、软件 1. 紫外可见吸光光度分析方法1.1吸光光度分析法基本概念1.2紫外可见吸光光度分析法1.2.1浓度因子定量计算1.2.2标准曲线法定量计算1.2.3双波长吸光光度法1.2.4多波长吸光光度法1.2.5动力学吸光光度法1.2.6光谱分析1.2.7导数光谱分析1.2.8 其它吸光光度法分析方法紫外可见吸光光度分析方法、应用、软件2. 紫外可见吸光光度分析方法的应用举例l 2.
2、1 在环境保护中的应用举例l 空气中“甲醛”的测定l 2.2 在食品安全中的应用举例l 食品中“农药残留”的快速检测l 2.3 在生命科学研究中的应用举例l DNA/蛋白质浓度检测l 2.4 在医药分析中的应用举例l 小儿用盐酸麻黄素滴鼻剂的导数光谱测定法紫外可见吸光光度分析方法、应用、软件 4. Win-sp分光光度计工作站使用指导l 4.1 软件的安装l 4.2 联机l 4.3 光度测试演示l 4.4 时间扫描演示l 4.5 光谱扫描演示l 4.6 多波长演示l 4.7 农药残留检测演示3. Win-sp分光光度计工作站功能 3.1 基本测试功能l3.1.1 光度测试工作模式l3.1.2
3、时间扫描工作模式l3.1.3 标准曲线工作模式l3.1.4 光谱扫描工作模式3. Win-sp分光光度计工作站功能 3.2 具体应用功能l 3.2.1 多波长工作模块l 3.2.2 室内环境检测工作模块l 3.2.3农药残留快速检测工作模块l 3.2.4 DNA/蛋白质浓度检测工作模块3. Win-sp分光光度计工作站功能3.3 辅助功能l l 3.3.1 文件的存储l 3.3.2 图形处理l 3.3.3 报告打印l 3.3.3 邮件发送1.1 吸光光度分析法基本概念 l1.1.1吸光光度分析法理论依据l 吸光光度分析法是基于不同的分子结构的物质对电磁辐射的选择性吸收而建立起来的分析方法，属于
4、分子吸收光谱分析。l在某一特定波长光的作用下，物质的浓度和吸光度值成正比；在某物质的浓度不变的情况下，改变作用光的波长，吸光度也将发生变化，这表明，分子的吸光度值（A）和波长（）为函数关系，同时和该组分的浓度（C）为函数关系。这就是吸光光度法定量分析和定性分析的理论依据。 1.1 吸光光度分析法基本概念 1.1.2.2 分光光度计吸光度值的计算l分光光度计检测器中的模拟信号经A/D转换为数字信号，保存到存储器中，这个值我们称为能量值（Energy），透过率的计算就是基于能量值。l透过率（Transmittance）：T =（Es-E0）（E100-E0）100 %l 吸光度（Absorbanc
5、e）：A = - log 10Tl E100：吸收池中为参比（可能是空气）时的能量值l E0 ：无光束通过吸收池时的能量值l Es ：吸收池中为待测样品时的能量值 1.2紫外可见吸光光度分析法 1.2.1浓度因子定量计算l 紫外可见吸光光度分析法有定量分析和定性分析；但以定量分析为主。l浓度因子定量计算l 溶液的某组分的浓度C和吸光度A之间存在线性关系，当A和C之间的关系确定时，浓度C可以直读，令K为浓度因子，有l C = K A l 浓度因子K的取得l 1。由已知浓度的标准样品的吸光度值中计算出l K = C Al 2。 由标准曲线法获得1.2紫外可见吸光光度分析法 1.2.2标准曲线法定量
6、计算l先配制一系列浓度不同的标准溶液，在与试样相同的条件下，分别测量其吸光度，将吸光度与对应的浓度做图，所得的直线称为标准曲线或工作曲线。然后测定试样的吸光度，再从工作曲线中查出试样的浓度。l计算机中标准曲线法定量计算数据处理采用回归分析法。l 确定回归直线的原则是使它与所有实验点的误差的平方和为最小值。l 设回归方程为： y = a + b xl利用最小二乘法原理，求出回归线的斜率b和截距a。l r为Y 和x 变量之间的相关系数l 当 r 0.999 时 表明Y 和 x 之间存在线性函数关系。1.2 吸光光度分析法 1.2.3双波长吸光光度法l原理：以样品溶液本身做参比，用两束强度相等、波长
7、不同的单色光交替入射到同一样品溶液，测得吸光度A1、A2 。设两波长吸光度之差为A，样品溶液某组分浓度为C，样品溶液某组分浓度和A之间因子为K。l有：l A = A1 - A2lC = A Kl双波长吸光光度法主要特点： 可以对浑浊试样进行分析 可以进行双组分或三组分混合物同时测定l在药物分析中有广阔的使用。 1.2 吸光光度分析法 1.2.4多波长吸光光度法l原理：以样品溶液本身做参比，用多束波长不同的单色光交替入射到同一样品溶液，测得吸光度A1、A2 .An。设每个波长吸光度对应的系数K1、K2 Kn，设A为所有波长吸光度的代数表达式之和，样品溶液某组分浓度为C，样品溶液某组分浓度和A之间
8、因子为K。l有：l A = Ki AilC = A Kl 其中的系数K1、K2 Kn为经验值 1.2 吸光光度分析法 1.2.5动力学吸光光度法l动力学吸光光度法是通过研究样品吸光度随时间变化规律，来分析化学反应等平衡过程状态，或借此方法分析某种组分的一种方法。l一般可分为三类：l催化动力学方法（包括酶催化动力学方法）l非催化动力学方法（包括差动力学方法）l诱导方法l测量方法：起始斜率法、固定时间法、固定浓度法。l动力学吸光光度法最基本的测量方式就是时间扫描。l通过时间扫描，我们可以得到样品吸光度A的时间数列lA1、A2、A3.Anl 对这个时间数列我们可以得到A的几个统计指标： 动态范围 平
9、均值 标准差 平均差变异系数 -标准差变异系数1.2 吸光光度分析法 1.2.6光谱分析l1.2.6光谱分析l光谱分析是通过研究样品吸光度随波长变化规律，来分析样品的光谱（这里狭义为紫外-可见光谱）特征，并通过对比某种物质的标准图谱，来定性分析组分性质，并为下一步定量分析提供依据的一种分析方法。l光谱分析最基本的测量方式就是波长扫描。l通过波长扫描，我们可以得到样品吸光度A的谱图数据lA1、A2、A3.Anl对这个谱图数据我们常规处理就是光谱波峰波谷的扫描，对某个特征峰，我们可以由下面几个属性来描述：l 波长l 峰高l 峰类型1.2 吸光光度分析法 1.2.7导数光谱分析l导数光谱分析有一阶导
10、数光谱、高阶导数光谱分析。它是普通光谱分析的补充，当样品的两种组分在普通光谱分析中无法识别时，可以考虑导数光谱分析。l导数光谱的获得有两种方式：l直接通过同时记录两波长的A，进行一次完整扫描即可获得。l在计算机内通过程序对普通光谱扫描的结果进行求导获得。l对这个谱图数据我们常规处理就是同样是光谱波峰波谷的扫描，对某个特征峰，我们也可以由几个属性来描述（同光谱分析） 1.2 吸光光度分析法 1.2.8 其它吸光光度法分析方法l正交函数吸光光度法l混合组分的测定 流动注射吸光光度法 差示吸光光度法 浮选吸光光度法 固相吸光光度法 计量学吸光光度法l（多组分光谱定量方法）l最小二乘法l逆最小二乘法l
11、偏最小二乘法l非线性最小二乘法l改进矩阵法l卡尔曼滤波法2.1在环境保护中的应用举例空气中“甲醛”的测定l在室内环境检测有五个项目：游离甲醛、氨、氡、苯、总挥发性有机化合物（TVOC），其中游离甲醛、氨两项是用分光光度法分析的。l室内环境检测检测以民用建筑工程室内环境污染控制规范 GB 50325-2001及室内空气质量标准GB/T 18883-2002作为标准。l“游离甲醛”的检测方法是酚试剂分光光度法, 波长为630nm 。l“氨”的检测方法是靛酚蓝分光光度法, 波长为697.5nm 。l一、“游离甲醛”的检测l (1)检验原理l空气中的甲醛与酚试剂反应生成嗪，嗪在酸性溶液中被高铁离子氧化
12、形成蓝绿色化合物。根据颜色深浅，比色定量。l(2)检验仪器及软件l1.分光光度计： 723可见分光光度计；l2.Win_env环保工作站；l (3)试剂l吸收液：酚试剂C6H4SN（CH3）CNNH2HCI。2.1在环境保护中的应用举例空气中“甲醛”的测定l(4)工作流程吸收液等化学试剂的配置吸收液等化学试剂的配置室内环境空气样品采集室内环境空气样品采集标准溶液吸光度测定标准溶液吸光度测定样品溶液吸光度测定样品溶液吸光度测定结果计算结果计算标准曲线的绘制标准曲线的绘制2.1在环境保护中的应用举例空气中“甲醛”的测定(7) 检测示例2.2分光光度计在食品安全中的应用举例 -食品中“农药残留”的快
13、速检测l 食品中“农药残留”的快速检测是动力学吸光光度法的一个具体应用。仪器检测过程遵循国家标准GB/T5009.199-2002规定的酶抑制率法来检测蔬菜、水果中有机磷和氨基甲酸脂类农药残留。l(1)检验原理l检测所用的酶抑制率法是模拟人体温度（37C）环境下，通过测定食品中有机磷和氨基甲酸脂类农药残留对已酰胆缄酶活性的抑制率，来快速判断农药综合残留量。测定波长410nm。l(2)检验仪器及软件l1.分光光度计： 723可见分光光度计；l2. Win_Sp农药残毒检测工作站；l (3)试剂l1.提取试剂l2.酶l3.显色剂l4.底物2.2分光光度计在食品安全中的应用举例 -食品中“农药残留”
14、的快速检测l (4) 检测范围及灵敏度l蔬菜：l叶菜、果菜、豆菜、瓜菜（除胡萝卜、韭菜、茭白、蘑菇）l农药：l有机磷类：甲胺磷、对硫磷、氧化乐果、敌敌畏、甲拌磷、久效磷、杀扑磷等 l 灵敏度 0.5-5mg/kgl2. 水胺硫磷、甲基对硫磷、甲基异柳磷、乐果等 l灵敏度 8-10mg/kgl氨基甲酸酯类：克百威、涕灭威、丙硫克百威、丁硫克百威、抗蚜威、仲丁威、速灭威、残杀威、西维因、叶蝉散等 l灵敏度 0.2-2.5mg/kg （对照组用3毫升提取试剂代替样本提取液）2.2分光光度计在食品安全中的应用举例 -食品中“农药残留”的快速检测l (5) 检测流程取 样（取2克样本，非叶菜类4克，切碎
15、）提 取（加入20毫升提取试剂，震荡1-2分钟，倒出上清液，静置3分钟）抑制反应（于试管中加入50微升酶、3毫升样本提取液、50微升显色剂）培 养（把配制好的样品或对照组放入37-38C培养箱中培养30分钟）显色反应（取出培养好的样品，加入50微升底物，倒入比色杯，立即进行仪器测定）2.2分光光度计在食品安全中的应用举例 -食品中“农药残留”的快速检测(6) 检测示例 l 2.2分光光度计在食品安全中的应用举例 -食品中“农药残留”的快速检测l 农残测试界面2.3可见分光光度计在生命科学研究中的应用举例-DNA/蛋白质浓度检测l 蛋白质和核酸均有紫外吸收的性质，蛋白质在280nm波长处的紫外线
16、有最大吸收，核酸及其衍生物在260nm波长处紫外线有最大吸收，可以通过标准曲线法进行定量测定，也可用二波长、三波长方法消除干扰组分的影响，提高测试准确度。l1. 定点波长（280nm）定量测定蛋白质浓度l原理： 蛋白质对280nm的紫外线有最大吸收，这是因为含有酪氨酸和色氨酸的缘故，蛋白质溶液的280nm吸收值与其浓度成正比，可作定量测定。l仪器：752分光光度计l试管1.5*15cm（*9）l吸管 0.5ml(*1)、1ml(*3)、 2ml(*2)、 5ml(*2)。2.3可见分光光度计在生命科学研究中的应用举例-DNA/蛋白质浓度检测l试剂l卵清蛋白标准液：约1g卵清蛋白溶于100ml 0.9NaCl溶液，离心，取上液，用克氏定氮法测定其蛋白含量。根据测定结果，用0.9NaCl溶液稀释卵清蛋白溶液，使其蛋白含量为2mg/ml ，将2mg/ml蛋白质的溶液准确稀释1倍l未知浓度蛋白质溶液，有酪蛋白配制，浓度控制在1.0-2.5mg/ml范围内。l操作：l标准曲线的绘制，取8支干净试管，按下表编号并加入试剂：l加毕，混匀，用紫外分光光度计计测OD280，以光密度为纵坐标，蛋白浓度为横
