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1、快速检测牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量PCR技术建立及应用 快速检测牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量PCR技术建立及应用牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒（）引起的一种传染病，可引起许多临床症状和一些疾病，包括繁殖障碍、呼吸综合征、先天性缺陷、肠炎、持续感染（）和黏膜病（）等，易感动物除牛以外，还包括骆驼、绵羊、山羊、猪、鹿及多种野生反刍动物。该病毒呈世界性分布，广泛分布于美国、澳大利亚、新西兰、匈牙利、加拿大、阿根廷、日本、印度以及非洲和欧洲许多养牛发达国家，是危害养牛业的重要病原之一。研究发现，其感染宿主涉及到了大部分偶蹄家畜和部分野生偶蹄动物。每年死于感染的牛不少于万头，占饲养牛总数的。感染怀孕
2、母畜，造成胎儿产生免疫耐受，进而发展为持续性感染病畜，多数持续性感染动物外观健康，但生产性能下降，且成为重要的传染源。和猪瘟病毒（）同属黄病毒科瘟病毒属，基因组具有高度的同源性，能产生交叉免疫。能感染猪，在全球广泛分布，对于无的国家（澳大利亚、爱尔兰、英国、丹麦），其猪群中抗体的阳性率在，而其他一些国家，阳性率更高。在我国，专家预测猪群中抗体的阳性率在以上。在妊娠早期感染母猪，仔猪就会出现持续的感染，即胎儿通过胎盘感染，则仔猪形成免疫耐受，且持续性感染。仔猪形成的这种免疫耐受，可严重抑制活疫苗的免疫应答，导致猪群猪瘟野毒的感染，从而暴发猪瘟，对我国的养猪业造成了巨大的经济损失。鉴于对我国养殖业
3、（主要是养牛业和养猪业）造成的危害，建立一种准确、简便的病原检测方法，制定建议规程，对促进我国的养殖业健康发展、减少因该病引起的经济损失具有非常重要的意义，。实时荧光定量技术，是指在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该方法以其高灵敏度、高特异性、快速等优点在病原体的定性和定量检测方面得到了广泛应用。本试验应用荧光定量技术对病原进行快速定量检测，不但灵敏度比普通高，而且还避免了普通高污染率的缺点，因此，开展该方法的研究，将具有良好的应用前景。材料与方法材料 株、牛肾传代细胞（）、感受态细胞为湖北省农业科学院畜牧兽医研究所实验室
4、保存；猪瘟兔化弱毒疫苗购自武汉中博生物制品公司；牛拭子样品采集湖北省出现疑似牛病毒性腹泻病的牛场；培养液、新生牛血清为公司产品； 凝胶纯化试剂盒和质粒小提试剂盒购自上海生工生物工程服务有限公司； 质粒载体为公司产品； 连接酶为公司产品； 聚合酶为宝生物工程（大连）有限公司产品。2方法1.2.1阳性模板DNA的制备1）引物和探针序列。以的高度保守的端非编码区作为扩增靶区，设计并合成了一对引物和一条探针。具体序列如下：上游引物（）：； http:/wWW.LWlm.CoM下游引物（）：；探针序列（）：；探针修饰：；（）； 2）病毒培养。细胞经含小牛血清和双抗（青霉素 、链霉素 ）的培养液培养，待细
5、胞长成单层时，接种病毒液，吸附 ，其间不时摇动使液面均匀地铺在细胞上，然后加含小牛血清和双抗的维持液，继续培养，在细胞病变达以上时收获。3）常规。通过对反应条件与试剂的优化，确定如下反应方案：反应总体积为 ，其中 ， ，引物、各 （ ），模板 ， 聚合酶 ，加去离子水至。 反应条件为：预变性，；变性 ；退火 ，扩增个循环；最后延伸 。 4）标准阳性模板的构建。用上述引物进行常规反应扩增阳性模板，产物回收纯化后克隆到 载体中，构建重组质粒，将重组质粒转化入感受态细胞内，进行白斑筛选，保存菌液，将菌液送上海生工生物工程服务有限公司进行测序。将测序结果与报道序列进行比对，从测序正确的菌液中大量提取质
6、粒，质粒浓度用紫外分光光度计测定nm值，根据阿弗加德罗常数将浓度转换为拷贝数，保存，使用前稀释。2.2实时荧光定量该反应总体积 ，反应体系为：倍系列稀释的标准品或待测样品的 ，B ，、各 （ ），荧光探针 （ ）， （）， 聚合酶 ，去离子水加至 体系。反应条件为： ； ， ，个循环；72， ，检测荧光。2.3实时荧光定量反应标准曲线的建立分别以经梯度浓度稀释的质粒为模板进行荧光定量扩增，并利用随机软件进行分析，得到动力学曲线及标准曲线。2.4实时荧光定量检测方法的评价1）敏感性。标准阳性模板经倍梯度稀释，进行荧光定量检测，并与普通比较。2）特异性。对标准阳性模板、猪瘟疫苗毒株、未接种病毒的细
7、胞、去离子水进行荧光定量检测。试验结果经溶解曲线分析，验证其特异性。3）重复性。取份不同滴度水平的样品进行组间重复性荧光定量检测，反应重复次，验证实时荧光定量的稳定性。3临床样本检测取湖北武汉、京山、仙桃、黄冈等地奶牛场疑似的病料，进行常规、RTQ检测，以比较种方法的灵敏度。结果与分析特异性片段的扩增结果经琼脂糖凝胶电泳，产物大小约为 ，与预期结果相符（图）。菌液送上海生工生物工程服务有限公司测序，与预期结果相符。标准曲线及RTQ灵敏度以倍系列稀释的标准品（拷贝）为定量检测模板，在定量仪上检测，得到动力学曲线图和标准曲线图。在标准曲线的制作过程中，模板的起始数越低则值越大（值的定义是：每个管内
8、的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数）。一般认为当值在以上时，定量结果即被认为是不可靠的。图显示，当标准质粒浓度拷贝时，动力学曲线呈上升趋势，因此，该方法检测灵敏度为拷贝（该检测灵敏度为被检样品的质粒模板浓度，如换算为被检样品浓度应该是3拷贝，为了统一起见，以下检测结果均为质粒浓度）。图显示该方法定量检测的线性范围为-1拷贝，相关系数r 。特异性如图显示，对标准阳性模板有荧光显示；猪瘟疫苗毒株、对去离子水和未接病毒的细胞无明显荧光反应，表明RTQ检测方法具有良好特异性。重复性图显示扩增结果曲线形态基本吻合，证明该检测体系具有很好的重复性。RTQ与常规比较把阳性模板的细胞培养物用DEPC处理的
9、水做倍梯度稀释，并进行RTQ和常规检查，得到表结果显示，RTQ的检查灵敏度高出常规 倍。临床样品的检测对年采自湖北武汉、京山、仙桃、黄冈等地奶牛场犊牛拭子样品，进行常规、RTQ检测。结果显示在检测的份样品中，RTQ检测阳性份，阳性检出率为（）；常规检测阳性份，阳性检出率为（），说明RTQ比常规灵敏度高。讨论本研究在比较有关序列的基础上设计了对引物和中间标记的探针。经过引物筛选和反应条件的优化，建立了的快速定量检测方法，该方法检测灵敏度为拷贝，定量线性范围为拷贝，具有很好的重复性。试验结果显示该方法检测灵敏度比常规高倍。在临床样品的检测中，对疫苗毒株、犊牛拭子样品的检测结果显示该方法具有很好适应性。总之，牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量检测方法特异性强、重复性好、操作简单快速，整个过程可在 内完成。该方法具有其他方法无可比拟的优点，随着时间的推移，将可能成为检测牛病毒性腹泻病毒的最理想的标准。-全文完-
