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1、单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式*1正向间接血凝试验l省疫控中心l周迎春主要内容l背景l原理l实验器材的优化l试剂的优化l样品的优化l实验过程优化l判定标准l注意问题一、背景l正向间接血凝试验(IHA)是上世纪 60 年代在我国发展起来的血清学诊断技术，是一种用已知抗原检测未知抗体的试验方法，它的操作方法相对简单，实验原理也易于理解，在基层实验条件和技术相对落后的情况下经常被应用到，在一些动物疫病的免疫抗体检测、疫病诊断上具有现实意义。l林琳等研究表明应用猪瘟正向间接血凝法(IHA)与斑点酶联免疫吸附试验（dot- ELISA）以及猪瘟抗体免凝金标试纸条比较，对规模化养猪场
2、138份不同阶段猪血清进行检测，三种方法检测抗体的阳性率结果接近。二、原理l正向间接血凝试验的原理是将可溶性抗原吸附于与免疫无关的载体（红细胞）表面，此吸附抗原的红细胞与相应的抗体结合，在有电解质存在的适宜条件下发生的肉眼可见的凝集性反应。二、原理l充分理解正向间接血凝试验的原理，对整个试验的操作和结果判定都具有很大的指导意义。三、实验器材的优化l本实验所使用的实验器材包括微量血凝板，微量振荡器，移液器和吸头，为保证实验的顺利进行，要选择质量有保障，稳定性好的器材。三、实验器材的优化l1、微量血凝板l实验室经常使用的是有机玻璃材质 或者一次性的110底角的 96 孔 V 型微量血凝板。有机玻璃
3、板板可以叠放，不占实验室台面，处理样品量较大时合适，但每次用完需要清洗。清洗方法：一般先用清水浸泡，然后马上用高压清水冲洗，洗净后用手甩干板子倒置于37温箱中烘干。用前要先检查血凝板孔底是否干净，如发现有透光性差一点的孔，可用酒精棉签擦净。除了有机玻璃板以外，还有一次性血凝板，不需清洗，也不用担心板子不干净影响结果，但不能叠放，测定少量样品适合。三、实验器材的优化l2、 微量振荡器l使用振荡器振荡时间不宜超过 10 秒钟，振荡强度不能太大，先从小到大，中等强度即可。多块板叠加后振荡时要用手压住最上一板，以防上下的振动造成孔中液体溅出而影响实验结果的准确性。如果实验室没有它，也可用手轻拍血凝板的
4、边缘即可。三、实验器材的优化l3 、单、多道微量移液器l建议使用高质量的移液器，用定量移液器需要准备 50 微升和 25 微升两种。50 微升的用来加稀释液和稀释血清，25 微升的用来加血凝抗原。可调的移液器要选择与检测过程中加样量相近量程的移液器，吸取液体时动作要轻缓，防止溶液吸入过快，冲入移液器污染柱塞或造成堵塞漏气。一定要养成移液器用完后放在移液器架上的习惯，移液器如果掉到地下很容易损坏。用完后移液器用 75%的酒精棉擦拭，并把刻度调到最大值。三、实验器材的优化l4、 吸嘴l高质量的吸嘴经过处理后可以重复使用。处理方法：吸嘴用完后浸泡在清水里，先用清水漂洗，用超声波清洗器处理10分钟，换
5、水后用二层纱布包好，用洗衣机甩干，再用超声波清洗器处理 10 分钟，再用洗衣机甩干，高压消毒灭菌器中 121，20分钟即可，去盖放 37温箱中烘干。吸嘴用完后没有用清水浸泡的很难洗干净，不必重复使用。接触过高感染性材料的吸嘴要高温消毒后废弃。经过处理后的吸嘴如果尖头变弯，则质量不好，不要重复使用。四、试剂的优化l1、 抗原l液体正向血凝抗原摇匀后呈咖啡色，无块状物沉淀，静置后血球逐渐沉入瓶底。摇匀后能很快形成均匀混悬液的是好抗原，摇匀后仍有小块黑色沉淀物（血球团）的抗原建议不要使用。如果只做筛检看是否达到合格线，一瓶抗原可以检测 30 到 50 份血清。值得一提的是液体正向血凝抗原 48保存，
6、保存期3个月，不能冷冻保存。四、试剂的优化l2、对照血清l阴性对照血清呈淡黄色清亮液体，阳性对照血清微红或淡黄色略微混浊的液体。阴阳性对照血清可在- 15到 - 20保存，有效期 1 年。l3 、稀释液l稀释液无色透明，一般情况 48保存。用前建议将稀释液放 室温或37温箱中半小时后摇匀再用较好。试剂不能放置太久，最好新进现用。五、样品血清的优化l新分离血清尽快检测完，未检血清 - 20保存。冷冻血清待检时需融化，同时避免血清反复冻融影响检测结果。严重溶血、严重污染、腐败或有悬浮杂质的血清样品不宜检测，以免发生非特异性反应。六、实验过程优化l正向血凝实验过程包括：加稀释液，稀释待检血清，稀释阴
7、性、阳性血清，加血凝抗原，震荡静置，结果判定。在试验中要注意以下的问题：l1、加稀释液l在血凝板上16 排的 19 孔；第 7 排的 14孔，第6-7孔；第 8 排的 112 孔各加稀释液 50 微升。六、实验过程优化l2、稀释待检血清l取1号待检血清 50 微升加入第 1 排第 1 孔，并将枪头插入孔底，混匀后，从该孔吸取 50 微升移入第 2 孔，混匀后从该孔吸取 50 微升移入第 3 孔直至第 9 孔。此时第 1 排 19 孔待检血清的稀释度（稀释倍数） 依次为 12、14、181256、1512。每个待检血清样品均按上述方法稀释，每稀释一份血清要换吸嘴。每次滴加样本后应吸取稀释液并冲洗
8、几次，最后将滴头内的残液完全排尽，以尽可能的保证样品被全部加入反应孔。作倍比稀释前，应且记将滴头内的空气排尽，避免稀释时孔内产生气泡，直接影响结果判定。六、实验过程优化l3、稀释阴性对照血清l在血凝板上的第 7 排第 1 孔加阴性血清 50 微升，对倍稀释至第4 孔。此时阴性血清的稀释倍数依次为 12、14、18、116。第 6-7孔为稀释液对照孔。六、实验过程优化l4、稀释阳性对照血清l在血凝板上的第 8 排第 1 孔加阳性血清 50 微升，对倍稀释至第 12 孔。此时阳性血清的稀释倍数依次为 12、14、1812048、14096。l每次试验要做阴阳性对照，最好也做二孔空白对照，即孔中加
9、50 微升稀释液后加25 微升抗原。每次检测时阴性、阳性和稀释液对照只需各做一份。六、实验过程优化l5、加血凝抗原l被检血清各孔、阴性对照各孔、阳性对照各孔、稀释液对照孔均各加血凝抗原 25 微升。血凝抗原用前要充分摇匀，瓶底应无血球沉淀。一次实验过程应选择同一批号的抗原，并先从稀释度高的孔加起，避免滴头和孔内的液体直接接触。 六、实验过程优化l6、振荡混匀l将血凝板置于微量振荡器上振荡 10 秒钟，如无振荡器，用手轻轻摇匀即可。然后将血凝板放在白纸上观察各孔红血球是否混匀，以没有血球沉淀为合格。盖上玻板，室温下或 37下静置 2 小时，判定结果，也可将板置冰箱中冷藏延至次日判定。七、判定标准
10、l将血凝板放在白纸上，先观察阴性对照血清116孔和稀释液对照孔，均应无凝集（血球全部沉于孔底形成边缘整齐的小圆点），或仅出现“+”凝集（血球大部分沉于孔底，边缘稍有少量血球凝集）。阳性对照血清 12 到 1256 各孔（18 孔）应出现“+”到“+”凝集为合格（少量血球沉于孔底，大部分血球凝集）。如图 1 所示，该阳性血清滴度为1512 倍或记为 9log2。七、判定标准l在对照孔合格的前提下，观察待检血清各孔，以呈现“+” 凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价。因此正确识别“+”的凝集现象是最后结果判定的先决条件。一般的判定方法是将血凝板放在白纸上，在各对照孔符合要求的前提下，从开始出现沉
11、淀的孔观察起，至血球全部沉淀孔，综观这几孔，前后对比血球凝集和沉淀的发展情况，以1/2血球沉淀孔的血清稀释倍数为该份血清的效价。 七、判定标准附：血凝试验强度七、判定标准l例如 1 号待检血清15孔呈现“+”到“+”凝集，67 孔呈现“+”凝集，第8孔呈现“+”凝集，第 9 孔不凝集，那么就可判定该份血清的抗体效价为 1128，或者说 7log2。接种口蹄疫和猪瘟疫苗的畜群免疫抗体效价达到132（即 5log2；第 5 孔）呈现“+”凝集为免疫合格。八、注意问题l1、鉴于有些场猪瘟间接血凝试验的样品与 ELISA 方法相比符合率不一致，不少学者认为是牛病毒性腹泻抗体的干扰导致的，提出了间接血凝方法虽然简单，但不能区分猪瘟抗体与牛病毒性腹泻抗体。在实验中如果遇到这种情况，建议采用猪瘟抗体单抗阻断ELISA 方法进行检测，其结果更可靠些。八、注意问题l2、血凝板的孵育时间和判定l试剂盒要求使用 110底角的血凝板，判读结果时间应在 2 小时后为妥，冬天还可适当长一点，低于 1.5 小时会判断不准。 血凝板第 4 孔和第 5 孔的判断是这个试验的关键，判了第 4 孔则该份血清为阴性，判了第 5 孔则为阳性，阴阳之差往往就在这一下，不能不引起重视。
