《核酸的研究方法教学文案》由会员分享，可在线阅读，更多相关《核酸的研究方法教学文案（41页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、核酸的研究方法核酸的分离、提纯和定量测定核酸的超速离心核酸的凝胶电泳核酸的核苷酸序列测定DNA聚合酶链式反应（PCR）DNA的化学合成 制备天然核酸必需采用温和的条件，防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用一、核酸的分离、提纯和定量测定制备RNA时，最重要的是使RNase灭活：容器用0.1焦碳酸二乙酯（DEPC）处理。然后经过高温处理。 DEPC能使蛋白质乙基化而破坏RNase活性；加入强变性剂（如胍盐：可使所有蛋白质变性）使RNase失活；在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂（如RNasin)（二）RNA的分离 用0.14mol/L Nacl使DNP沉淀，上清中即为
2、RNA核蛋白（RNP）。盐酸胍、苯酚等去蛋白用酸性胍盐/苯酚/氯仿抽提：异硫氰酸胍是极强的蛋白质变性剂。后用苯酚和氯仿多次除净蛋白质用胍盐/氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离心，蛋白质在最上面，DNA在中间，RNA沉在底部mRNA的制备：oligo(dT)纤维素（琼脂糖凝胶）亲合层析法 制备RNA的方法：（三）核酸含量的测定2、定糖法 RNA：核糖 糠醛 绿色物质（670-680nm） DNA：脱氧核糖+二苯胺兰色物质（595-620nm）苔黑酚/地衣酚浓HCl浓硫酸1、紫外吸收法1个A50g/ml 双链DNA 40g/ml RNA或单链DNA3、定磷法 核酸含磷量为9.5% 1g磷相当于10.
3、5g核酸4、琼脂糖凝胶电泳 溴乙锭能插入DNA分子的碱基对间形成复合物在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光 荧光强度与DNA含量成正比细胞或组织中核酸含量测定方法生物组织酸溶性物质残留物冷的稀酸抽提脂类物质残留物热酸法冷酸法碱法残留物 酸抽提液(RNA + DNA)热酸提取残留物残留物酸抽提液 (DNA)热酸提取酸抽提液 (RNA)冷酸提取酸抽提液 (RNA)残留物(DNA)有机溶剂抽提碱降解再酸化纯DNA 比值1.8， 1.8 Pr、苯酚污染纯RNA 比值2.0， 2.0 DNA、 Pr、苯酚污染（四）、核酸纯度的测定OD260OD280二、核酸的沉降特性与超速离心 利用超离心技术，可以测定核酸
4、的沉降常数和相对分子质量。密度梯度沉降平衡超离心法在核酸分子构象的研究中应用颇广。DNA分析时，常用氯化铯密度梯度。主要应用于以下方面：1.核酸密度的测定2.测定DNA中的G-C含量3.溶液中核酸构象的研究4.用于核酸的制备8M CsCl，45000rpm，16h密度梯度：1.80g/ml1.55g/ml平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力=0 +4.22（r2 - r02） 10-10 ：未知DNA的密度0：为标准DNA的密度 ：角速度（弧度/秒）r：样品到转轴的距离r0：已知DNA到转轴的距离（一）核酸密度的测定G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系，因此可用能用该方法计算DNA碱基
5、成分，计算公式为：=0.1 xG-C + 1.658xG-C =（-1.658） 10需注意的是： 含5-甲基胞嘧啶多的DNA，其实际浮力密度会降低，低于理论值，不能用该公式计算。（二）测定DNA的G-C含量RNADNA变性DNA双链DNA 蛋白质，变性程度越大，浮力密度越大（三）研究核酸的构象（四）用于核酸的制备 不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来，利用EB（溴化乙锭）与核酸结合，能在紫外灯下发出荧光的特性，将目的区带收集。是当前核酸研究中最常用的方法。有许多的优点：简单、快速、灵敏、成本低。常用的有琼脂糖凝胶
6、电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。三、核酸的凝胶电泳（一）琼脂糖凝胶电泳用于大片段DNA或RNA的分离，精度低，但分离范围广。电泳迁移率决定于：（1）核酸分子的大小 （迁移率与相对分子质量对数成反比）（2）胶浓度 （迁移率与胶浓度成反比，常用0.71%）（3）DNA的构象：超螺旋线状分子开环状分子（4）电压 （一般5V/cm,电压与迁移率成正比)（5）碱基组成（影响不大）（6）温度（430都可以，常室温进行） 琼脂糖凝胶电泳常用于DNA分析；分析RNA时需加入蛋白质变性剂甲醛。电泳完毕用溴化乙锭（0.5g/mL）染色，用紫外光检测琼脂糖电泳用于DNA分子量的测定在同一凝胶中加入已知相对分子质量的样品（
7、分子marker) ，在电泳完成后，通过染色，照相，从照片上比较待测样品的DNA片段与标准样品的中的已知大小片段，可以推测待测未知DNA片段的分子大小。用于小片段DNA的分析相对分子质量小于1000bp的DNA片断和RNA的电泳。PAGE中一般不含RNase，用于RNA分析时不会分解样品。（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）（一）DNA的酶法测定四、核酸的核苷酸序列测定英国 Sanger1955 确定牛胰岛素结构，1958 获诺贝尔化学奖1975 设计出DNA测序法，1980 获诺贝尔化学奖合成一系列与待测DNA序列互补的DNA片段群。 末端终止法Sanger2，3双脱氧核苷三磷酸（ddNTP
8、）是DNA合成链延伸的抑制剂。DNA序列分析仪：四色荧光基团标记的dNTP（二）DNA的化学法测序：由Maxam和Gilbert所发明。其基本原理是用特异的化学试剂作用于DNA分子中的不同碱基，然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链。用4组不同的特异反应，可使末端标记的DNA分子切成不同长度的片断，其末端都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱 4组特异的反应如下：（1）G反应：用硫酸二甲酯DMS使鸟嘌呤上的N7原子甲基化，加热引起鸟嘌呤脱落，多核苷酸链可在此处断裂（2）G+A反应：用甲酸使A和G嘌呤环上的N原子质子化，从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂（3）T+C反应：用肼
9、使T和C的嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基（4）C反应：当有盐存在时，只有C与肼反应，并被哌啶除去。嘧啶使修饰碱基脱落，并使去掉碱基的磷酸二酯键断裂（三）RNA的测序 RNA的测序方法有3个：（1）用酶特异切断RNA链：胰RNase A：嘧啶核苷酸键米曲霉RNase T1：鸟苷酸核苷酸键黑粉菌RNase U2：腺苷酸核苷酸键多头黏菌RNase Phy I：A、G、U核苷酸键（2）用化学试剂裂解RNA（与DNA化学测序法类似）（3）逆转录成cDNA1995年K.Mullis发明。基本步骤为：1.设计一对引物以便有效扩增所需要的DNA序列，并尽量减少可能产生的非特异产物2.优化反应体系：包括适量模板、
10、引物、4种dNTP、耐高温的DNA聚合酶和适量Mg2+五、DNA聚合酶链式反应（PCR）3.选择3个温度进行热循环：变性94，4560s；退火，根据引物的Tm，一般为两引物中较低的Tm值减2，1min；延伸，72，1min。热循环25-30个周期，最后延伸10分钟。4.扩增完成后取出一定量的反应产物，检测扩增结果：先进行凝胶电泳，用溴化乙啶染色，紫外光下检测结果y=产物；x=扩增效率；n循环次数PCR技术十分灵敏，扩展效率非常高，通常可扩增106倍，其扩增产量可按下列公式计算。温度（温度（）时间（时间（minmin）9494727260609494变性（变性（1min1min）60 60 退火
11、退火（1min1min）72 72 延伸延伸（1.5min1.5min）循环循环1 1 循环循环2 2 循环循环3 3PCRPCR反应的温度循环周期反应的温度循环周期如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。PCR技术的应用-：（1）遗传病和某些疑难病的诊断以及孕妇的产前检查（2）病原体的检测（3）法医和刑侦鉴定（4）癌基因的检查（5）基因组探针的制备（6）基因组测序、染色体巡视（7）cDNA库的构建（8）基因突变的分析和定位诱变（9）DNA重组（10）基因的分离和克隆六、DNA的化学合成P521图15-6固相合成法（亚磷酸三酯法）合成DNA合成方向：3 5端5-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护。3-OH用氨基亚磷酸化合物活化碱基上氨基用苯甲酸保护 二对甲氧三苯甲基
