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1、 荧光量子点标记技术在生物医药领域的研究进展 高勇 郭艳 安维 韩亚丽 张娟丽摘要：荧光量子点标记技术作为荧光标记技术领域的最为先进的技术，因其无放射污染性、低细胞毒性以及检测技术成熟等优点，已经成为现代生物医药领域研究中的不可或缺的手段和技术。本文从各类荧光量子点制备、表面功能化方面的最新技术进行详细论述，对其在生物医药领域的如细胞内外物质追踪、生物组织成像、疾病早期诊断等方面的研究趋势和应用前景进行了展望。Abstract： Fluorescent quantum dot labeling technology， as the most advanced technology in the
2、 field of fluorescent labeling technology， has become an indispensable means and technology in the research of modern biomedicine because of its advantages of no radioactive contamination， low cytotoxicity and mature detection technology. In this paper， the latest technologies in various quantum dot
3、 preparation and surface functionalization are discussed in detail， and the research trends and application prospects in the field of biomedicine， such as intracellular and extracellular material tracking， biological tissue imaging， early disease diagnosis， etc.， are prospected.关键词：荧光标记;量子点;生物医药;应用研
4、究Key words： fluorescent labeling;quantum dots;biomedical;application research：Q503 ：A ：1006-4311（2019）30-0280-030 引言荧光标记技术与放射性物质标记、发光物质标记、生物酶标记技术一并被称为应用分析标记技术，由于其无放射性污染、低细胞毒性以及检测方法成熟可靠等突出优点，已经成为现代生物医药领域研究中的不可或缺的手段和技术。荧光量子点（Quantum Dots）1作为无机荧光材料的典型代表，属于人工制备纳米半导体材料，粒径范围在1-20nm之间，可依据其粒径的大小具备不同的荧光颜色，常见
5、的类型如 II-VI 类（Cd Te、Cd Se、Cd S），II-V类（In P、 In As），I-III-VI2 类（Cu In S2、Ag In S2）和 IV-VI 类（Pb Se）。这些量子点在各种医学应用如生物成像，生物信息的傳感和药物的递送等众多的应用中发挥着非常重要的作用。荧光量子点是近年来被广泛研究的荧光标记探针技术，相对于荧光素类、罗丹明类常见有机荧光标记分子，其接受激发波长范围宽，并且产生发射波长分布窄，可以实现一种激发波长同时激发多种不同粒径和材质的多种量子点，实现多种标志物的同时监测，并具有较强的抗光谱漂白能力;由于是稳定合成的化学纳米物质，其光源稳定性好，不易产生
6、荧光淬灭，稳定时间长;可供选择的低细胞毒性、高生物相容性量子点逐渐被发现，能够进行体内成像的研究;其生物标记方法，可通过其表面的多种化学基团，进行生物分子如特异性抗体的标记和示踪。1 荧光量子点的制备量子点的合成研究是关于量子点研究的重要内容，具有基础性的地位，一直以来受到国内外研究者的重视。目前荧光量子点制备主要分为有机相合成和水相合成两大类。另外，近年来生物合成方法也被逐渐的开发出来。1.1 有机相合成1993年Bawendi2出现了一种新的合成方法：“金属有机-配位溶剂-高温”路线，以TOPO和TOP为溶剂、以Cd（Et）2和S（Se、Te）反应前驱体，高温情况下，向含有Cd（Et）2的
7、TOPO溶液注入S（或Se、Te）的TOP溶液，使其高温下成核生长。该合成方法形貌可控，发光效率高，但是高温，Cd（Et）2剧毒，不稳定，成本高，容易爆炸等缺点限制了其应用。Peng3在前人的研究的基础上，从基本的化学知识出发，找到了控制合成的关键因素，主要是针对Cd（Et）2的剧毒，不稳定，合成条件苛刻等方面进行了创新研究。最新的制备可以在非极性溶液中对其形貌生长进行精确控制，以合成应用最为广泛的量子点。1.2 水相合成水相合成的量子点具有无毒性和优越的生物相容性等优点，Weller4研究了引入巯基小分子束缚量子点的生长，在水相中合成CdTe量子点。董绍俊5使用Na2TeO3作为Te源，将其
8、和Cd2+、配体分子、NaBH4加热回流，得到高质量的CdTe量子点。2014年，Wu等6水相制备CdTe 量子点，并进行蛋白修饰。1.3 生物合成利用各种生物体进行荧光量子点的胞内外合成是近几年量子点合成一个研究热点，2009年pang7等提出了全新的“时-空耦合调控活细胞合成策略”，开启生物合成的先河。目前硫族量子点CdS在生物合成方面研究的最为深入8。可供生物合成的量子点微生物有细菌（大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、光合细菌沼泽红假单胞菌等），真菌（酵母）等。2015年，Borovaya等9首次证实担子真菌系统合成硫化镉量子点的可能。另外在其他生物机体如放线菌、蓝藻、植物（番茄毛根等）、病毒（
9、烟草花叶病毒等）、动物（蚯蚓）也被发现可以用来合成量子点12。但是这类方法合成的量子点种类有限，且发光效率不高，以及产能的制约等不足，目前无法大规模的工业化应用。在上述化学和生物合成的方法基础上，量子点制备技术不断进步，多元素、多材料的复合结构使得量子点的发光性质更加稳定，应用更加的广泛。2 荧光量子点的功能化和标记荧光量子点的功能化主要是对量子点表面进行一系列的修饰，使得可以和生物大分子等物质连接，进一步在生物医学领域应用。针对表面修饰基本策略是两个：第一个是包裹，在表面包裹上亲水性物质，使其亲水;第二个是替换，将表面配体替换成亲水的物质使其亲水。这两个策略来自1998年1011Alivis
10、atos和Nie，两人从不同的角度解决了这个问题，开启了生物应用的大门;Alivisatos在量子点表面包覆了一层硅，再利用相关硅烷的反应，在量子点表面修饰了亲水的氨基，而Nie则利用配体交换策略，在量子点表面修饰了亲水的巯基羧酸，之后再利用量子点表面修饰的基团进行蛋白等大分子连接，作为荧光探针进一步的应用。早期的比较常用的修饰方法是建立在这2个策略之上，利用两亲性分子、小分子肽段疏水包裹法1213 14。水溶性配体交换的方法常用的配体交换试剂有巯基小分子、谷胱甘肽等141516，这类修饰的方法有一个共同的特点是量子点表面的配体发生了变化，荧光效率会有不同的下降。还有将量子点包裹在二氧化硅微球
11、中、块状共聚物胶束中、聚苯乙烯微球大大提高了检测的敏感性，此类的修饰方法基于多个量子点单体聚合成多个，检测敏感性提高，但修饰方法合成工艺复杂，要求高，形貌不易控制，修饰后的量子点一般在1-10um，尺寸的增大限制了其应用。近年来将量子点使用两亲性聚合物修饰171819，这类聚合物有羧甲基壳聚糖和辛胺接枝的聚丙烯酸、聚丙烯马来酸酸酐等不仅可以保证发光效率，而且制备的微球粒径可控、稳定，易于工业化生产。因此采用不同类型的聚合物修饰量子点来达到应用目的是当前重要的研究热点。功能化的量子点进行生物交联标记常用方法有EDC法、戊二醛法和SMCC（或SPDP）法等。表面有羧基官能团的量子点可以使用EDC将
12、其活化后与生物分子的氨基进行连接;而表面有羧基官能团的量子点则可以使用戊二醛将其活化后再连接生物分子的氨基，或者使用SPDP活化后连接生物分子上的巯基（生物分子无巯基时还可以用ITL试剂在其氨基上连接上巯基）。3 荧光量子点的生物医学应用量子点生物学应用的起步始于1998年，Alivisatos和Nie同时创新性的解决了量子点标记后的生物相容性难题，实现生物大分子与量子点的结合。随后量子点开始广泛应用于包括DNA检测技术、免疫荧光技术和细胞生物学的多种生物技术中。3.1 量子点在体内应用Alivisatos等人采用两种量子点标记小鼠的成纤维细胞，证明可以将生物分子通过静电力、氢键或者亲和力结合
13、在量子点表面。Nie等人使用巯基乙酸改性过的CdSe量子点，与转铁蛋白化学交联后，可借助转铁蛋白进入细胞内部，可追踪供体-受体反应。Gao20等利用单细胞标记分析更加高效将量子点在生物细胞方面的应用向前推进。张炎21等研究了新型水溶性量子点Zn3In2S6与抗CEA抗体形成荧光探针，对结肠癌细胞株进行靶向标记，合成的荧光探针的细胞毒性大幅降低。Nafiujjaman22的研究表明，新型的Cl-GQDs-N量子点直径在30nm左右，并且在体外试验中表明，对癌细胞和正常细胞，均没有毒性作用，具备在细胞成像方面的应用前景。3.2 生物成像方面由于近红外光（650-900nm波长范围）不易被生物体内背
14、景吸收，所以量子点在活体成像方面具备不可比拟的优势。Akerman M E，Gao等人2324证实通过小鼠静脉注射生物标记的量子点后，量子点能够特异性的聚集在小鼠的特定组织上并且成功的显像。3.3 量子点在体外诊断量子点应用在体外诊断中，主要用作为荧光探针作为信号物质，从而直接或间接的用于蛋白质的检测。李萌25等采用EDC/NHS的办法将HCV核心抗原的一株抗体偶联到量子点上，磁微粒連接另一株抗体，建立双抗体测HCV核心抗原的快速检测，检测时间和灵敏度较传统的ELISA都有提高。郭爱玲26等使用EDC/NHS将制备好的CdS量子点与单增李斯特菌抗体IgG偶联，偶联CdS量子点的单增李斯特菌抗体
15、的特性没有发生变化，之后采用直接荧光法在荧光显微镜下快速灵敏地检测出了单增李斯特菌。余皓27等制备CdSe/ZnS量子点，再将量子点标记抗抗钙素单抗，制备成免疫层析试纸条及其配套荧光检测设备用于检测血液中PCT，检测结果和现有方法一致，具有无需前处理可全进行血测量、荧光检测设备成本低、操作简便等优势。Hao Yu28等将量子点多色的功能和层析纸条结合，采用双色（575nm和640nm）量子点分别标记CRP和PCT的抗体构建免疫层析系统，同时在血液中快速检测CRP和PCT。Jinghua He29等使用量子点作为荧光探针，双抗体夹心法在试纸条上检测肿瘤标志物CA724和罗氏的电化学发光法基本一致，开始向肿瘤标志物检测领域延伸。4 展望熒光量子点作为标记物有着其独特的优势：较大的斯托克斯位移，从而不受激发光源的干扰;可以实现多色荧光，而激发光波长一种即可;抗光漂白性极强，有着非常长的荧光寿命;有着很高的量子产率，荧光信号极强等优点。近年来，国内外学者对荧光量子点的制备和标记方法进行了大量的研究，我国学者对量子点在生物医学方面的应用进行了较深入的研究，对进一步商业化、产业化夯实了基础。参考文献：1量子点：现状、机遇和挑战.浙大学报 2014 研究前沿发布暨科学家论坛上的报告.2Murray C B， Norris D J， Baw
