中药多糖的三维纳米基因传递的研究

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1、中药多糖的三维纳米基因传递的研究分类号：:编号:壁垒墨三垒江朦人擎硕士学位论文中药多糖的三维纳米基因传递研究付敏作者姓名指导教师金江直熬拯虫线堂申请学位级别亟土学科专业论文答辩H期三生鱼旦论文提交日期三生旦学位授予单位和口期三生鱼旦江菱太堂独创性声明本人郑重声明:所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己注明引用的内容以外，本论文不 包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果，也不包含为获 得江苏大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论

2、文作者签名：村数R期:为年月学位论文版权使用授权书江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊光盘版屯子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内 容和纸质论文的内容相一-致，允许论文被查阅和借阅，同吋授权中国科 学技术信息研究所将本论文编入中国学位论文全文数据库并向社会 提供查询，授权中国学术期刊光盘版电子杂志社将本论文编入中 国优秀博硕士学位论文全文数据库并向社会提供查询。论文的公布包 括刊登授权江苏大学研究生院办理。本学位论文属于不保密呵。学位论文作者签名：付匀肿補躲兮叶山年月口江苏大学硕士学位论文摘要基因

3、治疗能否成功很大程度上取决于是否具有安全高效的基因传递系统，如 何开发合适的基因转运载体是基因治疗研究的关键问题。本研究着重于将传统中药的多糖成分应用于基因传递，开发阳离子化多糖基因转运载体，并结合聚乳酸.轻基乙酸，支架构建三维基因传递系统。中纱多糖三维基因传递系统不仅为寻找安全高效的基因转运载体提供新的思路，同吋也为中药资源的多样化应用提供实验基础和技术支撑。以传统中药为原料,采用水提醇沉法提取粗多糖，再依次通过二乙氨乙基葡聚糖凝胶柱分离纯化出中性总多糖成分纤维索离子交换柱和O主要由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，其糖醛酸含量为 ,范围内时，能促进大鼠骨髓间充总糖含量为.。当浓度在广鹏质干细胞

4、，的增殖，其中在.嵋?。浓度范围内对的增殖率表现为浓度依赖型,且均高于阳性对照纤维粘连蛋白。中药多糖本身不带正电荷,不具有亲和性，需要将其进行阳离子化才能结合。本文先使用， 拨基二咪哇将中的疑基氧化成醛基，再与小分子聚乙烯亚胺，反应生成酰胺键，将接枝到上，得到阳离子化的。以转化生长因子质粒。一为报告基因，不同质量比制备 /纳米粒进行琼脂糖凝胶电泳,发现半/比值大于时，可以将】完全滞留在原孔，证明成功连接后，携带正电荷并具有核酸亲和性。/.纳米粒的屯位随着纳米粒中比例的增大而升高。/纳米粒/:为均一球体，平均粒径大小为O使用三种比例的/?纳米粒:,:,:处理后，其表达水平均高于脂质体、和游离质粒

5、对照组。其中，半。/为：时，纳米粒的转染效率最高。以静电纺丝法制成的薄膜支架为研究对象，考察细胞在支架上进行三维培养的可行性。选择接种效率较高的沉淀接种法接种细胞，以 中纱多糖的三维纳米基因传递研究X个/为接种密度，可以在保证细胞数量的同吋使细胞具有一定的生长空间。倒置显微镜拍摄的照片显示，所接种的细胞可以紧密粘附在纤维上，提示此薄膜支架适宜于的三维培养。在此前提下，选择转染效率最高的/ 一纳米粒/:,以静置冻干法与支架复合,制成./.转染系统，并用相同的方法制备./.及基因传递系统，比较结果显示，同等条件下三维转染与二维转染相比转染效率得到明显提高，其小./.转染效率最高，且未显示细胞毒性,

6、说明所制备的三维纳米基因传递系统兼具安全性及有效 性，是一种具有发展潜力的新型基因转运载体。关键词：中药多糖，支架，三维基因传递江苏大学硕士学位论文,%.嵋旷，% 9 /V, ，/中纱多糖的三维纳米基因传递研究一 ,/一. /./一/,/:,:，:9 /,9 % ,/ 一曲江苏大学硕士学位论文 * ?中药多糖的三维纳米基因传递研究H录弓言?？综至?.基因治疗简介基因转运载体研究概况病毒载体和非病毒载体简介.经典天然多糖作为基因载体的研究现状？中药多糖阳离子聚合物在基因传递中的应用中药多糖的药理活性 阳离子化中药多糖作为基因载体的可行性 中药多糖在基因转运中的应用.支架介导的三维基因传递研究进展

7、. 支架制备方法？ 支架在基因传递中的应用总结与展望?中药多糖的提取分离纯化及初步评价。实验材料与仪器?.实验材料?.实验仪器实验方法? 中药多糖的提取分离纯化. 中药多糖的性质评价? 小药多糖对骨髓间充质干细胞的增殖作用?。结果与讨论.葡萄糖浓度吸光度标准曲线的建立纤维素柱洗脱曲线?柱洗脱曲线? 一江苏大学硕士学位论文 多糖的提取效率？ 多糖的外观及溶解性?.理化鉴定总糖含量测定?.红外光谱？。.糖醛酸含量测定薄层色谱法分析单糖?处理后的细胞形态对细胞的增殖作用.本章小结?.二维纳米载基因系统的构建及其基因传递？。实验材料与仪器?.实验材料？.实验仪器？。实验方法?. /?纳米粒的制备?纳米

8、粒的表征？/ / 一纳米粒的基因传递研究结果与讨论. 的红外光谱.质粒？的浓度与纯度? 琼脂糖凝胶电泳电位一.纳米粒的形态与粒径?.转染效率？毒性评价? 本章小结?.中药多糖的三维纳米基因传递研究三维基因传递系统的构建与基因传递研究?柏实验材料与仪器实验材料.实验仪器实验方法细胞接种方法的考察 ?/.系统的构建及基因传递？结果与讨论？ 支架的扫描电镜细胞接种方法的选择. 在支架上的粘附增殖? 接种子/中的形态 三维基因转染结果？.三维基因转染系统的毒性评价？.二维与三维转染效率的比较?本章小结全文总结?.本文创新点.研究总结？一工作展望？.参考文献致谢.攻读硕丄期闻发表的相关论文江苏大学硕士学

9、位论文引言基因治疗，是指通过生物工程手段，将具有治疗作用的外源基因导入靶细胞 中，以纠正或补偿由于基因缺陷和异常引起的疾病，从而达到治疗的FI的。基因 治疗在许多疾病治疗方面都获得重大进展，具有极好的发展前景，构建安全高效的 基因传递系统是基因治疗研究中的关键课题。理想的基因转运载体应具备安全无 毒、稳定性好、生物相容性好、可降解、工艺简单、成本低等特点。H前，许多国内外研究者在对秃聚糖、环糊精、葡聚糖等天然多糖进行阳离 子化修饰后，成功地使这些阳离子化多糖发挥基因传递作用，证明多糖在基因 传递方面具有广阔的应用前景。传统的中药多糖來源广泛成本低、制备工艺成熟, 以制备阳离子聚合物的思路对其进

10、行深度开发,有利于扩展中药多糖的作用范围, 提升中药资源的利用水平。本文以传统中药为研究对象，提取分离其中的中性多糖 成分，并使用小分子聚乙烯亚胺对其进行阳离子化修饰,使其成为带正电荷的O能够与呈电负性的转化生长因子质粒,发生静电络合形成稳定的纳米粒结 构,发挥二维转染作用。与传统的二维细胞培养方式相比，支架介导的三维培养与体内环境更加相 似，更加利于细胞的生长，能够明显促进细胞增殖。三维基因传递系统相对于二 维基因传递来说转染效率更高,并且能够实现基因的控释以及定点表达。本文以静 电纺丝法制备的聚乳酸一轻基乙酸?,支架为力学支撑，构建./.三维传递系统，并对其转染效率及安全性进行进一步探讨。

11、中药多糖的 三维纳米基因传递研究综述基因治疗简介随着分子生物学和免疫学技术的发展,基因治疗作为生物学治疗的一个重要成部分受到广泛关注，具有极好的发展前景。基因治疗,是指通过生物工程手 段,将具有治疗作用的外源基因导入靶细胞中，以纠正或补偿由于基因缺陷和员 常引起教授的疾病，达到治疗的H的【】。自从年美国科学家首次实施基因治疗的临床试验以来，截止到年月，全球范围内已有个基因治疗临床试验得到批准。H前基因治疗在抗肿瘤】、心血管疾病【、 帕金森综合症【、血友病【、骨组织再生【等许多方面都得到了广泛的应用。基因转运载体研究概况由于裸分子较大，亲水性强，易被核酸酶降解，因此将直接导入细胞效率极低【】。基

12、因治疗能否成功很大程度上取决于是否具有安全高效的 基因传递系统,如何开发合适的基因转运载体是基因治疗研究的关键。理想的基因转 运载体应该具有安全无毒、稳定性好、生物相容性好、可降解、易被细胞吸收、组 织靶向性好、转染效率高、H的基因能够持续表达、工艺简单、成本低等特点。传 统的基因转运载体主耍分为病毒载体和非病毒载体两大类。其中，阳离子聚合物是 非常重要的一类非病毒载体，天然多糖多数通过制成阳离子聚合物发挥臬因传递作 用。病毒载体和非病毒载体简介将外源基因色裹于天然病毒载体的外壳中，使病毒感染宿主细胞，可以将外 源基因导入靶细胞中。病毒载体主要包括逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、腺 病毒、腺相关

13、病毒等。虽然病毒载体可以温和地将基因整合,且可实现长期表达, 转染效率非常高【，但病毒载体木身具有很多局限性难以克服，比如病毒载体能够诱 导宿主产生免疫原反应，可能具有致癌性，靶向性差,具有逆转录插入突变风险， 装载率低,难以进行规模化生产，成本高等【，这些缺陷限制了病毒作为基 因转运载体的应用。非病毒载体主要包括脂质体、阳离子聚合物、纳米颗粒等【，。 与病毒载体不同，非病毒载体具有低毒、无病原性、无免疫原性、制备简单、 可重复江苏大学硕士学位论文给药、质粒免受核酸酶降解、装载率高和无致瘤性等优点，因此受到越来越 多的关注【】。然而，非病毒载体研究的最大问题在于其转染效率很低,如何寻 找_种转

14、染效率高的菲病毒载体己成为H前的研究的热点问题。.经典天然多糖作为基因载体的研究现状多糖是一类广泛存在的天然高分子材料,其稳定性高、无毒、具有良好的生 物相容性及生物可降解性，且生产成本很低。H前，国内外研究者己经对多糖作 为非病毒基因转运载体的这一应用开展了大量研究，并成功证明多糖在基因传递 方面具有广阔的应用前景。常用的应用于基因传递的天然多糖主要包括壳聚糖、环 糊精、葡聚糖等,大多数多糖通过制成阳离子聚合物的形式发挥基因传递作用。.壳聚糖壳聚糖是由甲壳素脱乙酰基形成的高分子直链型的可溶性氨基多糖,是口然 界中唯一存在的阳离子多糖。甲壳素广泛存在于真菌、虾蟹等甲壳动物及某些 植物的细胞壁中，年产量达几亿吨。研究表明，壳聚糖具有生物可降解性、生物相容 性、无毒无抗原性并具有多种生物活性-O壳聚糖分子在存在大量胺基，因而带 有较高的正电荷，能够与带负电的核酸产生静电作用形成聚合电解质络合物，构成 基因传递体系。作为基因转运载体，壳聚糖的