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1、 楤木皂苷A在大鼠体内的组织分布研究 郭东艳翟秉涛吕杨史亚军范妤王露王媚摘要楤木皂苷A为太白楤木中的主要活性成分之一。该文通过建立SD大鼠主要脏器中楤木皂苷A的LCMS/MS分析方法,同时口服灌胃楤木皂苷A 50 mgkg-1,测定大鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑)中的楤木皂苷A含量,探讨体内的组织分布特征。结果显示楤木皂苷A在SD大鼠主要脏器中的方法学考察符合要求,口服灌胃楤木皂苷A 50 mgkg-1,在心、肝、脾、肺、肾、脑组织均有分布且在1 h或2 h 时达到最大值。在给药后不同时间点楤木皂苷A的组织分布情况不同:给药20 min各组织含量:肝心脾肺肾脑;给药1 h各组织含量:肝脾
2、肾肺心脑;给药2 h各组织含量:肝肾心脾肺脑;给药4 h各组织含量:肾肝脾心肺脑;给药8 h各组织含量:脾心肝肾肺脑。提示楤木皂苷A主要分布于肝组织,这也与太白楤木常用于治疗肝脏疾病具有一定的相关性。另外,楤木皂苷A在脑组织中虽含量低但有明显分布,提示药物可能会透过血脑屏障,也为楤木皂苷A在脑组织的研究提供了依据。关键词楤木皂苷A; 组织分布; HPLCMS/MSAbstractAraloside A is one of the main active ingredients of Aralia taibaiensis In this study, HPLCMS/MS analysis met
3、hod of araloside A in the main organs of SD rats was established At the same time, the content of araloside A in the main organs (heart, liver, spleen, lung, kidney, brain) after oral administration with araloside A (50 mgkg-1) were determined to explore the tissue distribution characteristics of ar
4、aloside A in vivo The results showed that the methodological study of araloside A in the main organs of SD rats met the requirements, araloside A distributed in heart, liver, spleen, lung, kidney and brain tissues reached peak at 1 h or 2 h after oral administration with 50 mgkg-1The distributions o
5、f araloside A at different time points after administration were distinct as follows: the content of araloside A at 20 min:liverheartspleenlungkidneybrain; the content of araloside A at 1 h: liverspleenkidneylungheartbrain; the content of araloside A at 2 h: liverkidneyheartspleenlungbrain; the cont
6、ent of araloside A at 4 h: kidneyliverspleenheartlungbrain; the content of araloside A at 8 h: spleenheartliverkidneylungbrain Therefore, araloside A was mainly distributed in liver tissue, which had a certain correlation with the common use of Aralia taibaiensis in the treatment of hepatic disease
7、In addition, araloside A shows a low content but an obvious distribution in brain tissues, which indicates that the drug can pass through bloodbrain barrier, and provides the basis for the study of araloside A in brain tissueKey wordsaraloside A; tissue distribution; HPLCMS/MS楤木皂苷A(araloside A)為楤木属植
8、物太白楤木Aralia taibaiensis的主要活性成分之一,含量约占太白楤木药材质量的12%,其化学结构见图1。具有抗溃疡、抗肿瘤、促纤溶、降血糖、抑制肾素活性等药理作用15。1961年,楤木皂苷A首次被前苏联学者Kochetkov N K等6从辽东楤木中分离得到,并运用化学法初步确定其结构。随后的几十年,有关楤木皂苷A的研究报道主要集中在药效方面,而相关的药代动力学研究仅有2篇报道,1篇是Iskenderov G B等71991年发表,而另1篇Qi D等8以楤木皂苷A作为指标成分之一,对竹节参提取物进行药动学研究。众所周知,1个药物能否发挥药效,在一定程度上是由胃肠道的吸收和靶器官的浓
9、度决定。药物口服吸收进入机体后,将通过循环系统转运至机体的各组织脏器中,药物分布的特征不仅与机体各部位的生理特征有关,而且与组织亲和力,化合物自身的理化因素等密切相关。这将使药物在体内各组织分布产生差异性,从而影响药物的治疗效果和药物的蓄积以及毒副作用9。课题组前期已对楤木皂苷A的体内吸收进行了相关研究。本文拟在前期研究基础上,探讨楤木皂苷A的组织分布特征,了解其在体内各主要器官的浓度,为药物的研究、开发及药物作用至靶器官或更理想的靶部位提供参考。endprint1材料与方法11仪器与试剂岛津Nexera XR LC20AD 高效液相色谱仪(日本Shimadzu;Dgu20A3RDegassi
10、ng Unit;SIL20AXRAutosampler;CTO20A Prominence Column Oven);AB Sciex Qtrap 4500型质谱仪(美国AB Sciex公司);GeneSpeed X1型微量离心机(香港基因有限公司);BT25s型电子分析天平(天美控股有限公司);miVac样品浓缩仪(英国GeneVac公司)。楤木皂苷A(批号150916,纯度98%,成都普菲德生物技术有限公司 );川续断皂苷(批号160211,纯度98%,成都普菲德生物技术有限公司);甲醇和乙腈(Adamas Reagent,色谱级)。健康的SD大鼠30只,雌雄各半,体质量(23020) g
11、,购于第四军医大学动物试验中心,动物合格号SCXK(军)20120007。12色谱质谱条件121色谱条件色谱柱采用Hypurity C18(46 mm150 mm,5 m);柱温35 ,流速08 mLmin-1,进样量5 L,流动相A 01%甲酸水,B为乙腈,洗脱程序:06 min,35%50% B;68 min,35% B;在203 nm波长下测定。122质谱检测条件离子源采用ESI源;检测方式为负离子检测;采用MRM方式进行扫描;离子化电压-4 500 V,气帘气35 psi(1 psi=6895 kPa),离子源温度550 ,喷撞气Medium,喷雾气150 psi,辅助加热气250 p
12、si。楤木皂苷A和内标的离子对及质谱参数,见表1。13样品溶液的配制楤木皂苷A储备液:精密称量楤木皂苷A 1 mg,用50%甲醇溶解,制成质量浓度约为1 000 mgL-1的储备液。楤木皂苷A工作液:精密量取储备液5,10,25,50,100,250,500,1 000 L于离心管中,加入50%甲醇配制成不同系列浓度工作液,使得楤木皂苷A的质量浓度为501万mgL-1。川续断皂苷储配液:精密称量内标川续断皂苷 05 mg,用50%甲醇溶解,制成质量浓度约为50 mgL-1的儲备液。川续断皂苷工作液:精密量取储备液适量于离心管中,加入50%甲醇,制成质量浓度约为2 mgL-1的工作液。质量控制样
13、品:精密量取楤木皂苷A 10 L,添加川续断皂苷工作液10 L于15 mL离心管内经浓缩仪干燥,再添加200 L空白组织液,制得质量浓度约为5,500,4 000 mgL-1的质量控制溶液。14组织样品采集1012清洁级雌雄各半的SD大鼠30只,给药前15 h禁食不禁水。以楤木皂苷A 50 mgkg-1灌胃给药(给药体积为10 mLkg-1),给药后分别在033,1,2,4,8 h处死,立即解剖采集心、肺、肝、脾、肾、脑;生理盐水洗净,置于-20 冷冻保存。15组织样品的处理1315精密称取各组织05 g,用生理盐水洗净,2倍量蒸馏水匀浆,从中取200 L组织液,添加10 L的川续断皂苷,再添
14、加乙腈600 L涡旋2 min,13 000 rmin-1离心10 min后吸上清经浓缩仪干燥,200 L色谱甲醇复溶残渣后过022 m滤膜,吸5 L进样分析。16数据处理采用Microsoft office Excel软件进行数据统计和处理。数据测定值采用均值标准差表示。2结果21方法学考察1618211专属性取空白肝脏、空白肝脏组织中添加楤木皂苷A(50 gL-1)和内标川续断皂苷(2 mgL-1),实测肝脏组织样品(口服楤木皂苷A 2 h),按相应方法处理后进行分析,考察方法的特异性。结果表明,空白肝脏组织中没有物质干扰楤木皂苷A及川续断皂苷的测定,表明该方法的特异性良好,见图2。212
15、线性范围与定量下限精密吸取一定量的楤木皂苷A溶液,加入10 L内标川续断皂苷溶液和200 L空白组织液,配制成5,10,50,100,500,1 000,5 000 gL-1的楤木皂苷A标准添加组织样品,处理后进行加权(1/X2)计算,见表2。最低检测限(LLOD)的S/N3;定量下限(LLOQ)的S/N10。取LLOQ浓度质控样品,按相应方法求出楤木皂苷A的浓度。213精密度与准确度取3个不同浓度质控溶液,按相应方法求出楤木皂苷A的浓度。于1 d内测6次,3 d测3批,计算批内、批间 RSD(%)和RE(%),见表3。214基质效应与提取回收率取空白组织液200 L,先加入楤木皂苷A,再加入600 L乙腈,涡旋离心后吸上清用浓缩仪干燥,取200 L甲醇复溶残渣后过022 m滤膜,吸5 L进行分析,所得峰A 空白肝组织匀浆液;B空白肝组织匀浆液加对照品及内标;C大鼠口服灌胃2 h后肝组织匀浆液;1楤木皂苷A;2川续断皂苷。面积记为A。取空白组织液200 L,先加入600 L乙腈,涡旋离心后吸上清用浓缩仪干燥,再加入一定量楤木皂苷A,涡旋混匀2 min后过022 m滤膜,吸5 L进行分析得数据记为B。取用流动相配制的楤木皂苷A 50 L,混合均匀,吸5 L进行分析得数据记为C。楤木皂苷A的提取回收率=A/B100%