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1、用于同源重组引物设计的原则是 5 端的基因同源区和3 端的氯霉素抗性基因同源区组成 ,用于扩增氯霉素抗性基因利用含有质粒pKD46 的菌株BW25113,在阿拉伯糖诱导后, 表达噬菌体的3 个重组蛋白,宿主菌就具有了同源重组的能力.设计的引物5端有50 bp 的拟敲除基因的同源臂, 3端为扩增引物,以pKD3 为模板,扩增两侧含FRT 位点的氯霉素抗性基因（20bp）, 将此线性片段电转入具重组功能的感受态细胞,利用氯霉素平板就可以筛选到阳性转化体.再利用表达Flp 重组酶的质粒pCP20,可将FR T 位点之间的氯霉素抗性基因删除.Red重组系统的诱导和感受态细胞的制备将转化有 pKD46的
2、 BW25113菌株接种 , 30 培养过夜;次日 150接种至 100 ml LB培养基 (氨苄青霉素浓度为50 mg/ml) （70mg/L） , 30培养至 D600 = 0.25时 ,加入 L-阿拉伯糖至5 mmol /L (30mmol/l), 诱导 1 h (D600不能超过 0 . 6) ,使 pK D46上的 Exo、Bet和 Gam三个蛋白充分表达。冰上预冷 10 min, 4 000 r /min, 4 离心 10 min,弃培养基;用预冷 10%甘油离心洗涤 3次 ,浓缩 100倍成 1 ml的感受态细胞 ,每管 100l (最好新鲜制备感受态细胞 ,否则电转率将下降约
3、30% )。伤寒沙门氏菌 将pKD46钙转到伤寒沙门氏菌 30度培养24h，涂布氨苄100微克/毫升LB平板。2mmol/L L-阿拉伯糖 培养1h。对大肠杆菌基因做双敲除时,突变第2个基因的阿拉伯糖诱导最适时间比突变首个基因延长,诱导浓度为40m感受态细胞在浓度为100 mmol/L的L-阿拉伯糖诱导后,可得到更多重组子。最终确定,L-阿拉伯糖诱导时间为90min,37复苏2h。将BW25113/ p KD46 菌株置于30转接培养,30培养至OD600= 0. 6 时,分别加入阿拉伯糖至终浓度为20m、 40m、 60m、 80 m、 100 m, 比较不同阿拉伯糖诱导浓度对突变的影响结果
4、( 表4)显示,阿拉伯糖诱导浓度为40m 时突变效率最高。浓度高至100 m 或低至20 m 均会使诱导效率下降而导致所得突变体减少。实验结果与文献 69 报道的基本一致。PAO10.2%（10几mmol/l）L-arabinose during 3 hours, , 50 bp homology region, 电转化将同源臂引物扩增的氯霉素抗性基因片段约 500 ng加入感受态细胞 ,混匀 ,转入 0 . 2 cm电击杯中 ,用 Bi o2 Rad电击仪作电转化。电击条件: 200, 25F,电击电压 2.3 kV,电击时间为 45 ms,电击后迅速加入 1 ml的 LB, 150 r/m
5、in,37 培养 1 h,之后涂于氯霉素平板 (氯霉素浓度为 34g/ml) (12.5); 12 h后用 PCR法鉴定长出的氯霉素抗性克隆。1 . 5FLP位点专一性重组将 pCP20转入氯霉素抗性克隆 , 30培养 8 h后 ,提高到 42 过夜 ,热诱导 FLP重组酶表达 ,质粒也逐渐丢失。用接种环蘸菌液在无抗生素培养基上划板 ,挑长出的单克隆点到氯霉素抗性平板上 ,未生长的为氯霉素抗性基因已被 FLP重组酶删除。用鉴定引物作 PCR对氯霉素抗性消失的克隆进行鉴定。1 . 6 营养缺陷型表型鉴定1( 划线部分为同源臂,是从起始密码子开始的50 bp 的序列)ATGACACAACCTCTT
6、TTTCTGATCGGGCCTCGGGGCTGTGGTAAAACAACAGCGATTGTGT AGGCTGGAGA T G GA A C CGT G CGAA AA GC CT C TT T CGGT GT T A G CGT A A CAA CAA AA G AG CGA TTGT GT A G G CT GG A G下游同源臂引物H2 P2( 划线部分为同源臂,是从终止子向左45 bp的序列) :TCAACAATTGATCGTCTGTGCCAGGGCGCTGCGAATTTCAGAAATCACCTTAATTAACGGCTGACATGGGAATT AGT T A CG AT GG GT CAG AAT CGAAT CGA C CA G A C CGT AT T C CA C CGC TT AA TT AA CGG CT GA CAT GG GA AT T A G
