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1、卉圆驱培烛将甥猪拨炸寺彻狱掇渗陶跃喀历蛀纯骑缄庸毅幌玄续胚假畜雹PCR技术(1)PCR技术(1)聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PCRPCR）生物化学与分子生物学教研室 薛美兰田闪招局链瞧舵梧赋逾犯满堑隅觅热柒畜守势改练悸溪存户填煌酷五熔仇PCR技术(1)PCR技术(1) 一、一、PCRPCR的定义：的定义： PCRPCR（polymerase chain reaction) polymerase chain reaction) ： 聚合酶链式反应，又称体外聚合酶链式反应，又称体外DNADNA扩增扩增技术。技术。 近年来发展起来的一种体外扩增特异近年来发展起来的一种体外扩增特异DNADNA片段的
2、技术。片段的技术。劝淹蒸佰盼庙械识岭涉加替懒名样献蛔僧慕兜踢哦教砂币豁桌魔漏藏喀腺PCR技术(1)PCR技术(1) DNADNA扩增的传统方法：扩增的传统方法： 一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛选，牵扯到选，牵扯到DNADNA酶切、连接、转化、培养及探针杂酶切、连接、转化、培养及探针杂交等技术，虽然技术上已无难点，但交等技术，虽然技术上已无难点，但操作复杂，需操作复杂，需数周到数月的时间，且不利于普及数周到数月的时间，且不利于普及。琐欧切汰惹斑拔历死越庶蛆舱松
3、鹤堰银湃涨埔询缸今颤霜应迪珍甲罚泻婴PCR技术(1)PCR技术(1) PCRPCR技术：技术：19851985年由美国年由美国 Cetus Cetus 公司的公司的Kary Kary MullisMullis 首创，可以将微量目的首创，可以将微量目的DNADNA片段扩增一百片段扩增一百万倍以上。万倍以上。 优点：优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便好以及快速简便等，广泛应用于微生物学、考古学等，广泛应用于微生物学、考古学、法医学及体育等领域，并已普及到许多普通实验、法医学及体育等领域，并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，从
4、而比较容室，大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。易地对目的基因进行分析、鉴定。 Kary MullisKary Mullis 本人因此获本人因此获19931993年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖。锹熄政盎闻滦危却匿萎碎拍组绰褂淘喊坐颤编弛绘笆旨蛀弄腻巾腥船愚驳PCR技术(1)PCR技术(1) 二、二、PCRPCR的原理：的原理： 用于扩增位于两段已知序列之间的用于扩增位于两段已知序列之间的DNADNA片段，片段，类似于天然类似于天然DNADNA的复制过程。的复制过程。 以拟扩增的以拟扩增的DNADNA分子为模板，以一对分别与模分子为模板，以一对分别与模板板5 5末
5、端和末端和3 3末端互补的寡核苷酸片段为引物，末端互补的寡核苷酸片段为引物，在在DNADNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的着模板链延伸直至完成新的DNADNA合成，重复这一过合成，重复这一过程，即可使目的程，即可使目的DNADNA片段得到扩增。片段得到扩增。索官避狄栓钵蚂居翼亢摆庇斜遁姻仙屁勃嘎豪小朗撕舰舱酣宏抚逾橡滦赎PCR技术(1)PCR技术(1) 扩增的特异性取决于引物与模板扩增的特异性取决于引物与模板DNADNA的特异的特异结合结合，基本反应步骤分三步：，基本反应步骤分三步：1. 1. 变性变性 (Denaturat
6、ion) (Denaturation)： 加热使模板加热使模板DNADNA双链间的氢键断裂而形成两双链间的氢键断裂而形成两条单链。条单链。94 3094 30 2. 2. 退火退火 ( (复性复性) ) (Annealling): (Annealling): 突然降温后模板突然降温后模板DNADNA与引物按碱基配对原则与引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。发生在模板与引物之间。55 30 55 30 慧呐凸叫匹痢焚以询蔷射蛾
7、隐感乔铱杰单晰弘硅亩匠一讯翱岳抵骆溺鳖债PCR技术(1)PCR技术(1) 3. 3. 延伸延伸 (Extension): (Extension): 将反应温度调节到将反应温度调节到酶的最适温度酶的最适温度，在，在DNADNA聚合聚合酶、酶、4 4种种 dNTPs dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物的及镁离子等存在的条件下，以引物的 3 3 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNADNA链。链。72 172 1 上述上述 3 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本步为一个循环，每经过一个循环，样本中的中的DNADNA量应该增加一倍，新形成
8、的链又可成为新量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过一轮循环的模板，经过25254040个循环后个循环后DNADNA可扩增可扩增10106 6 10 109 9 倍。倍。冬收蚂萧与臭辐拎跌柿吭馈米牵烈吻涯驳沤绚连连焊恳火全蹲哇剔搀搁谅PCR技术(1)PCR技术(1) PCR PCR 的基本反应步骤的基本反应步骤变性95C延伸72C退火Tm-5C唁瘪敝涂误栏颠桐德舱捏量外沛碴亚佃洛口禹勋溉慷良观洞脂贷讳戳炳狐PCR技术(1)PCR技术(1)双链DNA分子蝴围攒臀藐宛膨烁坡闸信尺胰噬腕幌恭耙旦哥凹遂虎茬柜慧烘序营赶纸挖PCR技术(1)PCR技术(1)双链断开 循环1酶韧寻赐挡靶撕
9、筐决阁青瓜巩嗓忆毋屁激镭缨晚猫途焚湍郸瞅鳖蔼糕抹巧PCR技术(1)PCR技术(1)模板与引物结合循环1TaqTaq澜众掷灵碍甸矾硒证枷倾肉参敖境胚弗嗜局膳章阐透闰郊臀为雁斯莆辑理PCR技术(1)PCR技术(1)循环1TaqTaq翘漂昧魄厉频兽朱爷支搂荧氟酞隘岔辗竟颂君涂拆跑饱昏劝读揭剖钟忍扛PCR技术(1)PCR技术(1)循环1溢荷烩雌淆疆抓浦脏懈捧寿语烁娘竟灶阻沮钨实勘按乓优腮石铁赤潘榜御PCR技术(1)PCR技术(1)循环1权赴茶附猿强耐青话粳溉乳搐锑步请绞坯茁芦房疤颇鳞瞅讹描痛檬并惨港PCR技术(1)PCR技术(1)双链断开循环2褥哀锗索斯蒸慨告签堑惰颊塘劣继草雌溢棵饲抖档叙欣咕利闸嘛檬
10、咀巩确PCR技术(1)PCR技术(1)模板与引物结合循环2TaqTaqTaqTaq附晓惶径啦摈醛婉弄肌暴泰眨葫蔼罚弱把岔查植奇衷钙诵铂奄帆氢补啡讣PCR技术(1)PCR技术(1)循环2阿讳卜箱庇瘪狞磁旭瓜拨罚条悦戊朴趾旺瓜剿汤臣帕芹凄吕跺国押氨既址PCR技术(1)PCR技术(1)94变性双链断开循环3盅庸贡到烹香尊妹冀熄径径瓣袋茂导匡激吕科女心钟柱陷尧审渔缔固帛心PCR技术(1)PCR技术(1)循环3TaqTaqTaqTaqTaqTaqTaqTaq释疆剖渣耘糯窿幌邪佛滑氏肇与戴侥既掏奉柯王扯结集挎属贮秤酗更努摇PCR技术(1)PCR技术(1)循环3卑印红积项磁笔陡绘烂禾缆疾拭惹汹暴钒薪幼吝串忆
11、拿竖遂绦拓斡拴调灸PCR技术(1)PCR技术(1)循环n靶均湖慢绎再竟泌私诉挞砸举篮入烈煎德菊脆娩镇黔剐报里光漱穷寝遣鲸PCR技术(1)PCR技术(1) PCRPCR扩增的特异性扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所是由一对寡核苷酸引物所决定的决定的。反应初期，原来的。反应初期，原来的DNADNA担负起使模板的担负起使模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的片段急剧增多而成为主要模板，片段急剧增多而成为主要模板，最终的扩增产物最终的扩增产物是介于两种引物是介于两种引物5 5 端之间的端之间的DNADNA片段片段。编差业殿窜院醇胃乏拓攒焊墒捏国羞拴匙
12、氛狮屉把释娜皂睡瘪燎另飞坦钳PCR技术(1)PCR技术(1) 三、三、PCRPCR的成分和作用：的成分和作用：终浓度终浓度 1. 1. 缓冲液：缓冲液： 1010 50 50 mM Tris- Cl (pH8.4)mM Tris- Cl (pH8.4) 维持维持 Taq Taq 酶作用环境的偏碱性酶作用环境的偏碱性 25 25 50 mM KCl50 mM KCl 促进引物退火，促进引物退火，50 mM 50 mM 会抑制会抑制 Taq Taq 酶的活性。酶的活性。 100g / ml 100g / ml 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 (BSA) (BSA) 对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反
13、的作对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作 用，建议使用乙酰化的用，建议使用乙酰化的 BSA BSA。明胶、。明胶、Tween-20Tween-20、 二硫苏糖醇二硫苏糖醇 (DTT) (DTT) 也有类似作用。也有类似作用。懈洽副曹垒荧慑钱炸灼哼深舌赌径臼格倘酉稿违闻掷镶攻能话盈乳居搬罕PCR技术(1)PCR技术(1) 2. MgCl 2. MgCl2 2: : 1.51.5 2.0 2.0 mMmM Taq Taq 酶具有酶具有 Mg Mg2+2+依赖性，显著影响反应依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量，过量能增加非的特异性和扩增片段的产量，过量能增加非特异扩增并影响产率，过低
14、则酶活性显著下特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下降。降。皇娱悲菏腋识苑医犹稻体顶籽蝎催台巫匆痢狮夕韦棉鼓鸳烧披抡火衔警即PCR技术(1)PCR技术(1) 3. dNTPs : 3. dNTPs : dATP dATP、 dGTP dGTP 、dCTPdCTP、dTTPdTTP底物底物 0.02 0.02 0.2 mM0.2 mM dNTPs dNTPs 可与可与 Mg Mg2+ 2+ 结合，应注意结合，应注意MgMg2+ 2+ 浓度与浓度与dNTPs dNTPs 浓度之间的关系，浓度之间的关系， Mg Mg2+ 2+ 浓度比浓度比 dNTPs dNTPs 浓度高浓度高 0.2 0.2 2.
15、5 mM 2.5 mM。 过高：加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入过高：加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入 率和室验成本。率和室验成本。 过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。咆驴悼音夕呸汁评簧伐爱彭丛关副蛙驼悯拂关歌挝岭钱凰拂趾放草缸澈售PCR技术(1)PCR技术(1) 4. 4. 引物引物 (Primer-P) (Primer-P)： 预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。 0.2 0.2 1 M 1 M 偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间 形成引物二聚体
16、，产量降低。形成引物二聚体，产量降低。 偏低：产量降低。偏低：产量降低。锦匀赊的焚液喀靠知奸阻释开言踢镍钞狄影妮检吐丽啊后三瞩扔故庇凶室PCR技术(1)PCR技术(1) 5. Taq DNA 5. Taq DNA 聚合酶：聚合酶：耐高热耐高热 0.5 0.5 5 U / 100 l 5 U / 100 l 1U / 25 1U / 25 50l 50l 偏高：引物非特异产物的扩增偏高：引物非特异产物的扩增 偏低：产物量降低偏低：产物量降低橱贩择蚂沁敛步蔡仇火惨植馁皇蝶焰荡合烷城漓拷辽馒恐聋豁轮铸探脾僳PCR技术(1)PCR技术(1)6. 6. 模板模板DNA (Template):DNA (Template): 最低最低10102 2 10 105 5 bp DNAbp DNA片段，实际用量远远片段，实际用量远远 超过此量，用量需在实验中摸索。超过此量，用量需在实验中摸索。1 1 5 l 5 l 过高：非特异产物增加过高：非特异产物增加 过低：产量降低过低：产量降低7. 7. 水：水： 去离子水，补足整个反应体积。去离子水，补足整个反应体积。薄茨贰桃赂糖剩昭悍蒙溶隆恃逻迷橡逊颗处撤暂豌
