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1、第五章第五章 生物反应器及其检测生物反应器及其检测与控制系统与控制系统 第一节第一节 概概 述述 一、生物反应器的含义 广义：利用微生物、动植物细胞或酶等生物催化剂的功能进行生物化学反应的容器称为生物反应器。小至一支斜面和一只培养皿，达到几千立方米的发酵罐。 按所使用的催化剂，可将其分为酶反应器和细胞生物反应器。通常只把那些能控制各种参数的比较完善的容器系统才称为生物反应器，尽管它的体积有时也可以有0.5L或更小。 目前市场上有各种规模的生物反应器供应，按其规模一般可以分为 实验室规模：小于20L的反应器，主要用于培养工艺的研究； 中试规模：20100L为中试规模，它主要用于提供一定量的产品，
2、供纯化、临床前的各种检测和临床观察，也包括进一步的工艺优化实验； 生产规模：大于100L则为生产规模用生物反应器，它主要用于生产，提供产品。 划分不是绝对的，尤其是对生物细胞培养和微生物培养是有一定区别的，对于前者来说，10L也可以称为中试规模，而用于培养微生物的反应器，有人将100L甚至1000L还看做中试规模。 二、生物反应器的基本要求 生物反应器的用途：给动植物细胞或微生物的生长代谢提供一个最优的环境，从而促使其生长并在其生长代谢过程中产生出最大量最优质的所需产物。 理想生物反应器必须具备基本要求： 制造生物反应器所采用的一切材料，尤其是与培养基，细胞直接接触的材料对细胞必须无毒。 生物
3、反应器的结构必须使之具有良好的传质、传热和混合的性能。 密封性能良好，可避免一切外来的不需要的微生物污染。 对培养环境中多种物理化学参数能自动检测和控制调节，控制的精确度高，而且能保持环境质量的均一。 可长期连续运转，这对用于培养动植物细胞的生物反应器尤为重要。 容器加工制造时要求内壁光滑，以减少细胞或微生物的沉积。 拆装、连接和清洗方便，能耐高压蒸汽消毒，便于操作维修。 设备成本要求尽可能低。第二节第二节 生物反应器的类型及其基本结构生物反应器的类型及其基本结构 随着微生物发酵工业和动植物细胞大量培养技术的发展，在传统的搅拌式生物反应器的基础上， 出现的新型生物反应器： 气升式生物反应器 固
4、定床式生物反应器 流化床式生物反应器 袋式或模式生物反应器 中空纤维生物反应器 固定化培养的生物反应器等。 一、搅拌式生物反应器 搅拌式生物反应器是最经典和最早被采用的一种生物反应器，医药工业中第一个大规模微生物发酵生产青霉素的过程即是在机械搅拌式反应器内进行。 到目前为此，对于新的生物过程，首先的生物反应器仍然是搅拌式反应器。它适用于大多数的生物过程，形成标准化的大量培养。它主要有以下一些部分组成（见下图P81） 1.罐体 小于5L的实验规模是生物反应器一般用玻璃制作，大于5L的则用不锈钢。为了获得较好的混合和溶氧效果，用于培养微生物的罐体其高径（H/D)一般为23:1.但在培养动物细胞时，
5、由于它对搅拌的剪切力敏感，搅拌速度一般较低，因此其径比一般采用11.5:1,以便增大液体与空气的接触面。 采用不锈钢制作罐体时，为便于观察，内部培养情况，常在罐体上装有视孔。 在培养微生物时，由于搅拌速度较高，为防止形成湍流，在罐体上常装有挡板。 2.搅拌系统 搅拌的目的是使细胞和养分在培养基中均匀分布，使养分能充分地被细胞利用，同时还可以使气体分散成较小的气泡，增大气液界面，有利于氧的传递。 目前采用的搅拌系统主要有两种，一种是机械搅拌系统，另一种磁力搅拌系统，后者有利于罐体的密封，但不是用于大容量的搅拌式反应器。在培养微生物的发酵罐内，多数采用多层扁平叶片的涡轮式搅拌器，但在培养动物细胞的
6、生物反应器内，一般倾向于采用较大的倾斜桨式搅拌器，特别在培养微载体时更是如此，它可在较低的搅拌式速度下使载体悬浮。 3.加温和冷却系统 多数采用夹套和盘管系统，用于进行加热或冷却，以满足不同微生物和动植物细胞生长对温度的要求。 4.进出气系统 除厌氧菌的发酵培养外，其他的微生物和动植物细胞都需要不断供氧才能生长，空气需过滤除菌。培养微生物空气经装在罐体底部的气体分布器喷嘴形成气泡进入培养基。 培养基内一般均含有蛋白质，在鼓泡通气时可产生大量泡沫，在罐体内常装有消泡桨。 在培养动植物细胞时，气泡对细胞有一定的损坏，除改进分布器使气泡减少外，以开发多种无气泡的通气装置。或采用聚丙烯中空纤维膜或透气
7、的硅胶管。采用孔径0.33的聚丙烯中空纤维膜，2.3m/L，其氧传递率为810.6mg O2/(L.h)。为避免排出气体中的水汽使过滤器潮湿，在排气管路中加有冷凝装置。 5.进出也系统 生物反应器生物反应器的培养和连续培养，具体可分为5种： 批式培养：即将细胞和培养液一次性加入反应器内，待整个反映结束后将产物取出， 流加或补料培养：即在培养过程中根据培养物质的代谢需要，补充某种或某些养料物质，多数是葡萄糖或谷胺酰胺等能源物质； 半连续培养：即在培养过程中间隙地收集部分反应物，并补充部分新鲜培养基； 连续培养：即持续不断地收集反应物，同时持续不断地加入新鲜培养基，从而反应器内的反应条件处于恒定条
8、件。将物化参数均一的反应器叫做恒化器，将保持细菌数目均一的叫做恒浊器； 灌流培养：他与连续培养的不同处在于收集反应器时，细胞仍保留在反应器内，这样可大大提高细胞密度，也就提高了反应器的生产效率。为适应这些培养方式的需要，生物反应器需相应的装配必要的进出液、收集、控制以及将细胞进行分隔回流等的设备系统。 6.检测和控制系统 为了保证生物反应器的物化参数处在微生物或细胞生长的最佳条件下，现在的搅拌式生物反应器上均配备有各种传感器和控制系统，包括温度、Ph值、溶解氧、转速、液位等，有的还装备有测定罐压、培养物粘度、浊度等传感器。 7.管线和接头 整套设备不可缺少的组成部分。 实验室规模的小罐一般采用
9、硅胶管，接头分别有内外磨口的玻璃接头、不锈钢接头等，它们都便于拆装，并可直接用火焰消毒以防止连接时污染。 中试生产规模的管道和接头则均为不锈钢管道和阀门连接。 二、气升式生物反应器 气升式生物反应器特点：气体通过装在罐低的喷管进入反应器的导流管、致使该部位液体的密度小于导管外部区域的导管密度。从而使液体循环流动，它以气体为动力，靠导管装置的应道，形成气液混合物的总体有序循环。 气内分：上升管和下降管。向上升管通入气体，使管内含气率升高，相对密度变轻，气泡变大，至液面处部分气泡破裂，气体由排气口排出。剩下气液混合物相对密度较上升管内的气液混合物大，由下降管下沉，下沉循环气升式反应器结构简单，不需
10、要搅拌。有两种构型，内循环式和外循环式。 与搅拌式生物反应器相比，剪切力小，混合均一，氧气和营养物质传递好，没有机械搅拌结构，有利设备密封，降低造价。见见P83P83 为了培养基良好的循环和充分混合，反应器的高径比一般在10:1左右。在培养动植物相比时，为了减少因气泡的张力对成本造成的危害以及由此、产生的泡沫，要求通气时产生了气泡直径为12mm，空气流量为0.010.06vvm。该反应器可用于微生物和悬浮成本的批式生产，也可用于贴壁细胞微载体培养，并进行半连续、连续和灌流培养。 三、中空纤维式生物反应器 中空纤维式生物反应器是由数百乃至数千根中空纤维集束组成的，该纤维材料为聚砜或丙烯共聚物。纤
11、维壁厚5075，呈多孔性，内层为超滤膜，可以截留相对分子质量为10000、50000或100000的物质，内腔直径200，两端用环氧树脂等材料将纤维粘合在一起，并使内腔开口与外加的塑料圆筒内，形成两个隔开的腔。内腔用于灌流充有氧气的培养基，外腔用于培养细胞。 中空纤维反应器既适应于贴壁细胞培养，液适应于悬浮细胞培养。当细胞接种于外腔后，细胞可附着于纤维表面，也可渗入海绵状纤维壁，13周后细胞可占据所有纤维间隙，并在纤维表面堆积，可达10多层细胞，细胞密度可保持较高的存活性、健康的形态和核型。该反应器占地空间小，产物质量高，生产成本低（生产ig纯化的单克隆抗体的生产成本，为用小鼠腹生产成本的2/
12、1，为搅拌式生物反应器生产成本的1/6）。 四、透析袋或模式生物反应器 在微生物或动物成本培养过程中，都会产生一些代谢产物，其中有些产物如乳酸、胺等会对细胞的生产产生抑制作用，因此设计出了透析袋或模式反应器，可将这些有害代谢产物透析或过滤掉，从而使细胞生长至更高密度，同时可根据需要选用不同相对分子质量的膜，使产物保留在膜内或与细胞分开。 最简单是直接将细胞置于透析袋内，并将其悬于一较大的盛有培养的容器内，然后旋转培养，容器内的培养基可不断更换，最后透析袋内的细胞密度可达107/ml，袋内单克隆抗体的浓度可达到12mg/ml。 模式生物反应器可由双式系统（培养基和细胞）或三式系统（培养基、细胞和
13、产物）构成，每室间隙高0.6mm，大小为28cm x 32cm，面积约为500cm2（室内有不同的氟碳填料，其表面积14007000cm2），根据需要可反复重叠成30400层，总面积达735m2。室与室之间的膜，可采用微孔滤膜（用于保留细胞），也可采用允许不同相对分子质量物质通过的超滤膜（用于保留产物）。它既可用于培养贴壁细胞，也可培养悬浮细胞。该反应器的优点是既可使细胞达到很高密度（细胞室内达108/ml），又可随意组合操作，从而达到保留和浓缩产品或及时分离提纯产品的目的。 五、固定床或流化床式生物反应器 固定床和流化床反应器：用于固定化酶反应，固定化细胞反应和固态发酵。 固定化主要优点：可
14、以重复利用生物催化剂，便于将生物催化剂与反应物分离。 通过固定化酶技术可以将酶截流在反应器内以便连续进行酶反应。有些酶固化后化学和物理性质发生变化，选择性强，寿命延长。适用于固定床和流化床的固定方法有物理吸附、共价结合、交联和包埋等。固定床反应的特点是结构比较简单，装填的材料可以是一切对细胞无毒、又有利于细胞贴附的材料，如不锈钢、有孔的玻璃、有孔的聚氨酯塑料等 。前一类材料细胞只能生长在表面，因而细胞密度不会太高，但比较经济，液体流动阻力较小，多数可重复使用，因而采用较多。后者由于有孔，细胞可进入载体内，因而可高密度培养细胞，但当载体过大时，在载体内的细胞常因营养物和氧的交换不够充分而影响其生
15、长和代谢。 Verax公司推出的CF-IMMO培养系统多级流化床生物反应器及FS-2000流化床生物反应器专用于多孔微球的培养，微球由胶原制成，直径约500m孔径2040m，比重为1.61.8g/ml。当培养液从流化床下部往上以一定流速输入时，微球在一定范围内悬浮旋转，从而保证了微球内细胞可获得充分的养分和氧气。用sf-2000培养cho工程细胞产生t-PA，细胞密度和t-PA产量达到了很高水平（1108/微球，94mg/L). Celligen plus生物反应器是在原来的笼式通气搅拌式反应器基础上，将通气搅拌与固定床结合的一种生物反应器。它在原来的Celligen 罐体中部装一篮筐，中间装
16、填由50%的聚酯纤维和50%的聚丙烯制备的直径为6mm的小圆盘，称为fibra-cel，它具有很大的比表面积（120cm2/cm3)和空体积，既可用于贴壁细胞的附着，又有利于悬浮细胞在纤维间被固定。 由于其设计特殊的搅拌装置，在搅拌中可产生负压，迫使培养基不断流经填料，有利于营养物和氧的传递。该反应器可使杂交瘤细胞和CHO工程细胞的密度达到108/cm3床体积，单抗和t-PA的产量较微载体培养分别高于12和27倍。第三节第三节 生物反应器的控制和检测系生物反应器的控制和检测系统统 一、培养过程中需检测的物化参数 在微生物和动植物细胞的培养过程中需检测的各种参数，其中有直接在线经传感器检出、需要取样离线检测、须经检测后计算才能获得。 为了反应器个物化参数在细胞培养和产物分泌的最佳状态，反应器都装有传感器和控制系统。 检测参数的全面性和控制系统的精确性反映了生物反应器的水平。二 、生物传感器生物传感器涉及物理信息学、生物芯片、生物控制论、仿生学、生物计算机等学科，处在生物科学和信息科学的交叉区域它们探索和提示生命系统中信息的产生 、存储、传输、加工、转换和控制等基本规律，探讨应用于人类经济
