浅谈豆瓣中酵母菌的分离与研究 关键词：纯化菌落菌落形态豆瓣酵母菌酵母菌是酿造食品中的重要微生物，葡萄酒、果酒、啤酒、白酒等酒类饮品中的醇香、酯香主要来源于酵母菌的发酵，面包、馒头等食品制作中的发泡来源于酵母菌生长产生的二氧化碳，其他的食品如酵素、泡菜等，酵母菌也起着重要的作用[1]豆瓣是四川地区传统酿造食品，是川菜中不可缺少的调味品，具有“红褐油润、酱酯香浓郁、味甜醇厚”等特点豆瓣中的酯香、醇香是否与酵母菌有关呢？为了解此问题，该实验选择了四川地区常用的两类豆瓣：家庭自制和企业生产，计数其中酵母菌的数量并分离纯化主要的酵母菌1、材料与方法1.1 材料家里自制豆瓣（贮存1年）、市售豆瓣（淘宝购，品牌：绍丰和，贮存3年）1.2 培养基麦芽汁琼脂培养基（青岛海博生物生产，成分包括麦芽浸粉130.0g/L，氯霉素0.1g/L，pH5.6）1.3实验方法1.3.1 酵母菌计数平皿菌落计数法1) 培养基制作称取65.05g培养基，加热溶解于500mL蒸馏水中，分装于两个500mL三角瓶，管口用硅胶塞塞上，再扎上牛皮纸，121℃高压灭菌15min2) 其他用具准备无菌生理盐水：称取5.4gNaCl，溶解于600mL蒸馏水中，分别分装于两个250mL三角瓶和8支18180mm的试管，三角瓶中分装225mL，加入小玻璃珠10个，管口用硅胶塞塞上，再扎上牛皮纸，试管中分装9mL，管口用硅胶塞塞上，再扎上牛皮纸，121℃高压灭菌30min。
无菌移液管8支：将10mL的移液管口塞上棉花，用牛皮纸包裹，121℃高压灭菌30min无菌培养皿20个：取直径9cm的培养皿20套，用牛皮纸包裹（分成两包），121℃高压灭菌30min无菌药匙2个：取2个不锈钢药匙1个，用牛皮纸包裹，121℃高压灭菌30min3) 样品稀释液制备将无菌操作间及洁净工作台的紫外灯打开照射30min，关上紫外灯，10min后进去操作准确称取豆瓣样品25g，放入装有225mL无菌生理盐水并放有小玻璃珠的三角瓶中，置摇床上室温振荡20min，静置20~30s，制成10-1稀释液；再用无菌移液管吸取10-1稀释液1mL，移入装有9mL无菌生理盐水的试管中，吹吸3次，制成10-2稀释液；按照此方法，连续稀释，制成10-3、10-4、10-5的稀释液4) 平板接种培养取10-3、10-4、10-5两种稀释度菌液1mL放入无菌培养皿内，培养基加热熔化后冷却至50℃，迅速倒入平皿，盖上皿盖，每皿20~25mL，混合均匀，凝固后放入恒温培养箱，温度为28℃，正放2h后倒置培养3d每个稀释度做3个平行样5) 计数选取菌落数在10-150CFU的平板，计数平板上的菌落数，3个平行样菌落数的平均值乘以稀释倍数即为样品中酵母菌的数量。
1.3.2 菌种分离纯化平皿划线法1) 培养基制作平皿培养基制作：称取13.01g培养基，加热溶解于100mL蒸馏水中，盛于250mL三角瓶，管口用硅胶塞塞上，再扎上牛皮纸，121℃高压灭菌15min，灭菌锅自然降温，降至100℃以下后取出培养基，待培养基冷却至50℃后在无菌室中以无菌操作趁热倒入无菌的培养皿中，盖上皿盖，每皿15mL，凝固后放入28℃恒温培养箱培养2d，除去培养皿表面的水分斜面培养基制作：称取13.01g培养基，加热溶解于100mL蒸馏水中，趁热分装于15150mm的试管，每管5mL左右，管口用硅胶塞塞上，再扎上牛皮纸，121℃高压灭菌15min，灭菌锅自然降温，降至100℃以下后取出培养基，趁热放在有斜度的实验台上，使其凝固后的斜面长度在试管的1/2~2/3，凝固后放入28℃恒温培养箱空白培养5d，除去培养基表面的水分，并检查斜面上有无菌苔生成，如有则弃之不用2) 划线挑取1.3.1步骤长出的菌落，在平皿培养基上划线，反复3次，挑取单菌落于斜面培养基上保藏3) 形态观察①菌落形态观察[2]无菌室中，以无菌操作从菌株斜面上挑取少量菌体划线在平皿培养基，28℃倒置培养3d，观察菌落的颜色、形状等。
②显微形态观察无菌室中操作取一洁净的载玻片，中央滴一滴无菌生理盐水，用接种针以无菌操作从培养皿的菌落上，挑取少量菌体，放在载玻片的液滴中，并将菌体挑开，勿使成团，加上盖玻片，放在显微镜下观察物镜先用20倍，再用40倍，观察细胞的形状、出芽等情况2、实验结果2.1 酵母菌计数家里自制豆瓣样品和市售豆瓣样品中均存在酵母菌，每克样品的酵母菌数均在一百万以上（见表1），市售豆瓣样品中菌数稍低于家里自制样品，可能因为市售样品贮存期较长而导致一些菌死亡2.2 酵母菌分离纯化在两个样品中均分离纯化到两株酵母菌，分别命名为DBY-1、DBY-2DBY-1：菌落中等大小，白色，圆形，光滑，湿润，边缘整齐显微镜下观察细胞圆形或卵圆形，出芽（见图1）DBY-2：菌落较大，白色，毛状显微镜下观察细胞呈柱形，单个或连接成链（见图1）3、结论以家里自制豆瓣和市售豆瓣为材料，通过平皿菌落计数法研究其中酵母菌的数量，结果表明两种样品中酵母菌的数量均在百万以上，市售豆瓣样品中菌数稍低于家里自制样品，可能因为市售样品贮存期较长而导致一些菌死亡；采用划线法从两种样品中均分离到了两株形态不同的酵母菌DBY-1和DBY-2酵母菌是食品酿造过程中的重要微生物，能代谢产生多种有利于食品安全或风味的化合物，如乙醇和乙酸具有防腐作用，可抑制有害菌的生长，防止食品腐败；酵母菌还能产生甘油、高级醇、芳香杂醇及酚类、呋喃酮类化合物等，赋予发酵食品特殊的甜香、果香等风味[3]。
豆瓣是四川地区重要的酿造食品，但关于酵母菌在其中的作用研究较少，该研究的结果表明豆瓣中存在数量较多的酵母菌，并从不同的样品中分离获得了两株形态不同的酵母菌无论是自制还是市售的豆瓣，其含有的大量酵母菌是其具有独特酯香、醇香的物质基础来源，也证明了在传统的风味食品中酵母菌起着至关重要的作用参考文献:[1]付俊淑,庄世文,徐丹丹,等.酵母分离株分子鉴定及其挥发性香气成分检测分析[J].食品与发酵工业,2010,36(2):44-48.[2]Barnett JA,Payne RW,Yarrow D.Yeasts characteristics and identification(酵母菌的特性与鉴定)[M].青岛:青岛海洋大学出版社,1991:17-31.[3]张倩,杨涛,姚灿,等.郫县豆瓣中一株耐盐酵母菌的分离鉴定及其发酵性能[J].天然产物研究与开发,2018(30):1509-1514,1520.罗睿星,谢义鹏.自制与市售豆瓣中的酵母菌分离与分析[J].科技资讯,2019,17(20):195-197.-全文完-。