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1、 芹菜素影响非小细胞肺癌A549细胞顺铂敏感性的RAD51基因调控机制研究 莫琳 刘馨 杨慧敏 何欣蓉 王小林 唐春红摘 要 目的：從RAD51基因途径研究芹菜素对非小细胞肺癌（NSCLC）A549细胞顺铂敏感性的影响及其机制。方法：取人肺癌顺铂耐药细胞A549/DDP，分为对照组（空白培养基）、顺铂组（5 g/L）和芹菜素低、高剂量组（10、20 mol/L），采用MTT法检测A549/DDP细胞生长，采用Annexin /PI双染色法结合流式细胞术检测其凋亡情况。取A549/DDP细胞，分为顺铂单用组（1、2、4、8、16 g/mL）和芹菜素联用组（10 mol/L，在顺铂基础上加用），采
2、用MTT法测定并计算细胞增殖抑制率;采用回归分析模型计算药物的半数抑制浓度（IC50），并以此计算芹菜素的逆转指数。将18只裸鼠随机分为对照组、顺铂单用组和芹菜素联用组，每组6只，接种A549/DDP细胞使形成移植瘤后，分别腹腔注射生理盐水、顺铂（2 mg/kg，隔天给药1次）、顺铂（剂量、用法同前）+芹菜素药液（30 mg/kg，每天给药1次），连续给药18 d，测量小鼠的体质量和移植瘤质量并计算抑瘤率。取人肺癌细胞A549和A549/DDP，分为正常组（A549细胞）、对照组（A549/DDP细胞）、顺铂组（5 g/L，A549/DDP细胞）和芹菜素低、高剂量组（10、20 mol/L，A
3、549/DDP细胞），分别采用实时荧光定量聚合酶链反应和Western blotting法检测细胞中RAD51的mRNA及其蛋白表达情况。结果：与对照组比较，芹菜素低、高剂量组细胞增长数均显著降低，凋亡率均显著升高且显著高于顺铂组（P0.05或P关键词 芹菜素;RAD51;非小细胞肺癌;顺铂;耐药;敏感性ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects and mechanism of apigenin on cisplatin sensitivity of NSCLC A549 cells by regulating RAD51 gene. METHODS：
4、Human lung cancer cisplatin-resistant cells A549/DDP were selected and divided into control group （blank culture medium）， cisplatin group （5 g/L）， apigenin low-dose and high-dose groups （10， 20 mol/L）. MTT assay was used to detect the growth of A549/DDP cells， while the Annexin /PI double staining c
5、ombined with flow cytometry were used to detect the apoptosis. A549/DDP cells were collected and divided into cisplatin alone group （1， 2， 4， 8， 16 g/mL）， apigenin combination group （10 mol/L， based on cisplatin）. MTT method was used to determine and calculate inhibitory rate of cell proliferation.
6、IC50 values of drugs were calculated by regression model， and reversion index of apigenin was calculated. 18 nude mice were randomly divided into control group， cisplatin alone group and apigenin combination group， with 6 mice in each group. After A549/DDP cells were inoculated to form the transplan
7、ted tumor， normal saline， cisplatin （2 mg/kg， once every other day）， cisplatin （the same dosage and usage）+apigenin solution （30 mg/kg， once a day） were injected intraperitoneally respectively. After 18 days of continuous administration， the body weight of mice and the mass of the transplanted tumor
8、 were detected and the tumor inhibition rate was calculated. Human lung cancer cells A549 and A549/DDP were collected and divided into normal group （A549 cells）， control group （A549/DDP cells）， cisplatin group （5 g/L， A549/DDP cells） and apigenin low-dose and high-dose groups （10， 20 mol/L， A549/DDP
9、 cells）， respectively. mRNA and protein expression of RAD51 were detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting assay. RESULTS： Compared with control group， the cell growth of apigenin low-dose and high-dose groups were decreased significantly， apoptosis rates of them were
10、increased significantly and higher than those of cisplatin group （PKEYWORDS Apigenin; RAD51; Non-small cell lung cancer; Cisplatin; Drug resistance; Sensitivity目前，化疗是非小细胞肺癌（NSCLC）的主要治疗手段之一，其标准化疗方案是以铂类为基础的联合化疗，但NSCLC患者在治疗过程中经常会出现对顺铂耐受的现象，这对化疗效果造成了严重影响，导致患者生存率低、预后不良1。由于NSCLC细胞对顺铂耐药的机制十分复杂，涉及多个基因和多条通路，
11、因此阐明顺铂耐药机制及寻找逆转顺铂耐药的有效途径已成为临床研究关注的重点。随着分子生物学研究的不断深入和“精准医学”概念的提出，越来越多的研究者开始从基因层面去探讨疾病的发生进展以及潜在的诊疗措施2。RAD51是一种新发现的蛋白基因，与细胞的生长密切相关，在细胞的增殖、分化、DNA修复和周期转换中发挥了重要的作用3。相关研究报道，在多种肿瘤（如肺癌、食管癌、乳腺癌等）组织中，RAD51蛋白呈异常高表达，提示其异常表达与肿瘤的分化、侵袭和转移密切相关4。芹菜素（Apigenin）是一种生物类黄酮化合物，广泛存在于自然界的绿色植物中，能够促进癌细胞凋亡、抑制癌细胞增殖和周期转换，具有较好的抗肿瘤作
12、用，其在乳腺癌细胞中改善顺铂耐药的作用也已经得到证实5。基于此，本研究针对芹菜素调控RAD51基因表达途径考察了其对人肺癌A549细胞顺铂敏感性的影响及机制，以期为芹菜素用于NSCLC等癌症的治疗提供实验基础。1 材料1.1 仪器JY2000型精密電子天平（上海精密科学仪器有限公司）;680型酶标仪（美国Bio-Rad公司）;HERAcell BB15型CO2细胞培养箱（德国Heraeus公司）;EPS300型电泳仪（上海天能科技有限公司）;Unio型聚合酶链式反应（PCR）仪（德国Biometra公司）;FACSCaliber型流式细胞仪（美国BD公司）;GDS8000型凝胶成像仪（英国UV
13、P公司）;5804R型台式离心机（德国Eppendorf公司）。1.2 药品与试剂顺铂原料药（山东齐鲁制药有限公司，批号：H20183460，纯度：99.8%）;芹菜素原料药（美国Sigma公司，批号：180623，纯度：98%）;胎牛血清、RPMI 1640培养基（上海明丰生物科技有限公司）;胰蛋白酶消化液、细胞裂解液（美国R&D Systems公司）;RAD51质粒中量抽提试剂盒、RAD51兔单克隆抗体、GAPDH兔单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）;辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗（英国Abcam公司）;青霉素-链霉素双抗、二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑盐（MTT）试剂（
14、美国Sigma公司）;Annexin -FITC/PI凋亡检测试剂盒、RNA提取Trizol试剂盒、TaqMan miRNA 反转录试剂盒、SYBR Prellix Ex TaqTM实时PCR试剂盒（日本TaKaRa公司）;PCR引物（美国Genewiz公司中国总部）;TBST缓冲液（北京索莱宝科技有限公司）;PVDF膜（美国Bio-Rad公司）;ECL试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、台盼蓝试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）;0.9%氯化钠注射液（天津百特医疗用品有限公司，作生理盐水使用）;pH 7.4磷酸盐缓冲液（PBS）为本实验室自制;其余试剂均为分析纯或实验室常用规格;水为超纯水。1.3
15、 细胞人肺癌细胞A549、顺铂耐药细胞A549/DDP均购自中国科学院上海细胞库。1.4 动物BALB/c Nude 裸鼠，SPF级，雄性，810周龄，体质量2025 g，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（沪）2018-0006。裸鼠在SPF级实验动物中心通风饲养，室内温度（212），相对湿度40%50%，空气更换频率15次/h，12 h光照明暗交替，实验场所及相关器材均严格清洗、消毒。裸鼠均适应饲养1周后进行实验，期间统一标准喂食、饮水。2 方法2.1 细胞培养将A549细胞和A549/DDP细胞常规培养于含10%胎牛血清的RPM1640培养基中，于37 、5%C
16、O2条件下培养，然后以胰蛋白酶（1 g/L）消化传代，每3天传代1次。其中，A549/DDP细胞培养液中添加顺铂（2 g/mL）以稳定耐药细胞株的耐药表型。取对数生长期细胞，以0.1%DMSO的RPMI 1640培养基稀释（下同），制成相应浓度的单细胞悬液并计数后用于后续试验。试验前以台盼蓝染色法测定，细胞存活率均在95%上。2.2 芹菜素对A549/DDP细胞增殖的影响考察取“2.1”项下对数生长期A549/DDP细胞，调整细胞浓度为5104个/mL，按每孔100 L加至96孔板中，随机分为对照组、顺铂组和芹菜素低、高剂量组。对照组仅加入A549/DDP细胞;顺铂组加入顺铂（终质量浓度为5 g/mL，剂量参考临床用药量对应的血药浓度设置）+A549/DDP细胞;芹菜素低、高剂量组同法加入不同剂量芹菜素（终浓度为10、20 mol/L，剂量参考文献6设置）+A549/DDP细胞。顺铂
