广西家蚕血液型脓病发病因子及其病原分子系统发育分析 王霞 黄旭华 蒋满贵 唐亮 董桂清 黄深惠 石美宁 潘志新摘要：【目的】明确病原[家蚕核型多角体病毒（BmNPV）]、寄主（家蚕品种）和环境条件（温湿度）的相关性并掌握BmNPV的感染力差异及传播规律，为蚕业生产上有效防控家蚕血液型脓病提供科学依据方法】测定从广西不同蚕区和不同季节收集的BmNPV毒株在不同温湿度条件下对不同家蚕品种的半数致死浓度（LC50），调查病原、寄主和环境条件三者对家蚕血液型脓病发生的影响;并基于bro-a和bro-c基因序列构建不同来源BmNPV毒株的系统发育进化树及进行相似性和遗传距离分析结果】15株不同来源BmNPV毒株对家蚕品种两广二号的LC50为2.1106～4.2106多角体/mL，毒株间的差异不显著（P>0.05）;不同BmNPV毒株在不同环境条件[春季（温度25 ℃和湿度90%）、夏季（温度35 ℃和湿度95%）、秋季（温度30 ℃和湿度85%）]下对家蚕的LC50排序均表现为春季>秋季>夏季，在夏季和秋季条件下，不同蚕品种对BmNPV的感染抵抗力排序为桂蚕N2>两广二号>桂蚕2号，桂蚕N2对BmNPV的感染抵抗力显著高于两广二号和桂蚕2号（P<0.05）。
不同BmNPV毒株在基于bro-a和bro-c基因序列构建的系统发育进化树上均聚在同一分支上，不同BmNPV毒株间的bro-a基因序列相似性很高、遗传距离较小，但不同BmNPV毒株间的bro-c基因序列相似度相对低、遗传距离相对较大结论】温湿度条件是广西蚕区家蚕血液型脓病发生的重要因子，且血液型脓病的发生流行与家蚕品种抗性也有密切关系关键词： 家蚕;家蚕核型多角体病毒（BmNPV）;感染力;发病因子;bro-a基因;bro-c基因0 引言【研究意义】广西属于亚热带季风气候区，高温多雨，有利于种养业生产发展的同时也适宜病原微生物繁殖感染而引发病害随着国家“东桑西移”工程的推进，广西蚕业取得了长足发展，其蚕茧产量自2005年起已成为全国第一大省（区），但在实际生产中同样面临着蚕病的严峻挑战，据统计广西蚕业生产因蠶病发生而造成的蚕茧损失在15%～20%，每年损失蚕茧数万吨，其中由家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）感染引起的血液型脓病是最普遍的传染性蚕病之一（闭立辉，2005;邵榆岚等，2017;唐芬芬等，2019）蚕病的发生是家蚕与病原微生物在一定环境条件下相互作用的结果，因此，调查BmNPV来源、家蚕品种及环境条件对家蚕血液型脓病的影响，有利于明确引发家蚕血液型脓病发生的关键因素，对科学防控家蚕血液型脓病危害及促进蚕业持续健康发展具有重要意义。
前人研究进展】鉴于家蚕血液型脓病对蚕业生产的严重危害性，至今已有诸多学者对其病原感染力及分子特征进行深入研究（黄深惠等，2012;Xu et al.，2013;唐芬芬等，2014;董战旗和潘敏慧，2017）孙京臣等（2001）通过调查广东 8个地区BmNPV对家蚕的致病力，结果发现不同地区的BmNPV致病力存在明显差异白兴荣等（2010）在调查云南蚕区不同地区BmNPV对家蚕的致病力时也发现不同地区的BmNPV致病力有明显差异，其半数致死浓度（LC50）相差最高达5个数量级黄深惠等（2012）调查广西蚕区10个地方BmNPV样品对家蚕的致病力，结果表明广西南部BmNPV的致病力普遍高于广西北部BmNPV，其LC50差异最高达9倍有关Bm-NPV基因的研究也取得重要进展，Maeda和Majima（1990）测序获得BmNPV全基因组，并证实该基因组是一个闭合环状的超螺旋结构DNA分子家蚕BmNPV基因组全长为128413 bp，包含136个开放阅读框（ORF）（Gomi et al.，1999;吴小峰，2006），但不同BmNPV株系的基因组核苷酸组成略有差异此外，已有研究证明bro基因是BmNPV基因组中的一种重要基因簇，是影响病毒复制与分化的因子，在病毒侵染宿主的过程中发挥重要作用（庞敏，2007;周敬波，2012;张媛媛等，2016）。
Gomi等（1999）研究发现BmNPV的bro基因存在bro-a、bro-b、bro-c和bro-d等拷贝，且基因拷贝数及片段大小因病毒毒株不同而有所差异王霞（2005）通过比较BmNPV的T3株系和SC7株系，发现T3株系中存在bro-a、bro-b、bro-c、bro-d和bro-e等5个拷贝，而SC7株系的相应区域仅有1个bro拷贝张媛媛等（2016）利用Red重组技术敲除bro-d基因，发现bro-d基因缺失导致BmNPV基因组复制水平下降Fujimoto等（2020）对比不同BmNPV株系的bro基因发现，La株系仅存在bro-a、bro-c、bro-d和bro-e等4个拷贝，与T3株系的同源性分别为98.7%、96.5%、95.4%和90.4%本研究切入点】广西是我国的新兴蚕区，但针对其主要蚕病病原特征及其流行规律的研究较少，尤其是有关家蚕血液型脓病发生影响因子及BmNPV的分子遗传特征至今未见报道拟解决的关键问题】基于病害发生的三要素（寄主、病原和环境条件），调查广西蚕区不同来源BmNPV毒株的感染力、不同蚕品种对BmNPV的抵抗力及不同环境条件下家蚕血液型脓病的发生情况，并研究不同来源BmNPV毒株的感染相关基因特性，旨在明确病原（BmNPV）、寄主（家蚕品种）和环境条件（温湿度）的相关性并掌握BmNPV毒株的感染力差异及传播规律，为蚕业生产上有效防控家蚕血液型脓病提供科学依据。
1 材料与方法1. 1 试验材料在广西南宁（Nn）、河池（Hc）、贵港（Gg）、百色（Bs）和来宾（Lb）5个蚕区，根据春、夏、秋不同养蚕季节分别收集BmNPV样品，样品具体信息见表1将收集的家蚕血液型脓病病蚕样品研磨、过滤（300目筛）和离心（2000 r/min，10 min）后配制成1107多角体/mL的病毒液，均匀涂抹于桑叶表面，给四龄起蚕添食，待家蚕发病后收集病蚕血液，2000 r/min离心10 min，纯化各BmNPV样品，4.0 ℃保存备用供试家蚕品种为两广二号、桂蚕2号和桂蚕N22Pfu PCR MasterMix购自天根生化科技（北京）有限公司，DNA Marker、pMD18-T载体和大肠杆菌DH5α感受态细胞购自宝生物工程（大连）有限公司，琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒（HDP202-1）购自上海惠凌生物技术有限公司;SDS、EDTA，NaCl和RaseA及无水乙醇等试剂均为国产分析纯1. 2 不同BmNPV毒株对家蚕感染力的测定将不同BmNPV毒株配制成1.0107多角体/mL的病毒液，并10倍梯度稀释成三级浓度，分别为1.0107、1.0106和1.0105多角体/mL。
将各级浓度病毒液分别添食给两广二号二龄起蚕，每个浓度设3个区，每区30头家蚕，添食方法为每区用3张桑叶（3 cm4 cm），取0.6 mL病毒液均匀涂抹在桑叶表面上，给二龄起蚕添食空白对照组桑叶表面均匀涂抹蒸馏水24 h后待家蚕食完桑叶后，用新鲜石灰粉进行蚕体蚕座消毒，清理、更换蚕座及垫纸，并更换普通桑叶喂饲每天上午以新鲜石灰粉进行蚕体蚕座消毒及清洁，并更新蚕座和垫纸一次，防止蚕座内二次感染至添毒96 h后家蚕开始发病，调查发病蚕头数，连续调查4 d，计算各区家蚕血液型脓病发病率，并使用GraphPad Prism 6.0的直线内插法计算不同BmNPV毒株对家蚕的LC501. 3 不同BmNPV毒株在不同环境条件下对家蚕感染力的测定模拟广西蚕区春、夏、秋的气候条件，在设置的3种环境条件[春季（温度25 ℃和湿度90%）、夏季（温度35 ℃和湿度95%）、秋季（温度30 ℃和湿度85%）]下收蚁、饲养两广二号至二龄起蚕;取广西南宁、河池、来宾、百色和贵港蚕区不同季节（春、夏、秋）的BmNPV毒株进行梯度浓度感染家蚕，感染和调查方式同1.2，计算各区的发病率及LC501. 4 不同BmNPV毒株对不同家蚕品种感染力的测定取家蚕两广二号、桂蚕2号和桂蚕N2分别在设置的3种环境条件（春、夏、秋）下进行收蚁、饲养至二龄起蚕，再取广西南宁、河池和百色3个蚕区不同季节（春、夏、秋）的BmNPV毒株进行梯度浓度感染家蚕，感染和调查方式同1.2，计算各区的发病率及LC50。
1. 5 不同BmNPV毒株分子系统发育分析1. 5. 1 DNA提取 将纯化后的300.0 μL BmNPV加入300.0 μL提取液（100 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，2.0 mol/L NaCl，0.1 mol/L Na2CO3，1% SDS，0.1 mg/mL RnaseA，pH 8.0）中，50 ℃孵育20 min，加入300.0 μL NaAC（3 mol/L，pH 5.2），12000 r/min離心10 min，将上清液转入灭菌的1.5 mL离心管中，向离心管加入0.35倍的无水乙醇室温放置10 min，12000 r/min离心15 min，弃上清液;加入1.0 mL 70%乙醇洗涤，12000 r/min离心3 min，弃上清液;沉淀重复用70%乙醇洗涤一次，弃上清液，保留沉淀，室温放置2 min后加入100.0 μL 1TE溶解沉淀，-20 ℃保存备用1. 5. 2 bro-a和bro-c基因扩增 参考已知BmNPV（登录号FJ882854.1）中的bro-a和bro-c基因序列，通过DNASTAR设计引物bro-aF（5-ATGGCTCAAGTT AAAATTGGAG-3）/bro-aR（5-GGCTTACAAGTTA AAATTGTTATTC-3）和bro-cF（5-GCATGGCTC AAGTTAAAATTGGAG-3）/bro-cR（5-TTATTGCGCGTTGCGCAAACTG-3），并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
以提取的BmNPV DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：2Pfu PCR MasterMix 25.0 μL，bro-aF/bro-aR（10 μmol/L）或bro-cF/bro-cR（10 μmol/L）各2.5 μL，DNA模板0.5 μL，ddH2O 19.5 μL扩增程序：95 ℃预变性4 min;95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行35个循环;72 ℃延伸5 min以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，120 V下电泳20 min，凝胶成像系统成像并进行观察按照琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒说明对PCR扩增产物进行切胶回收，连接至pMD18-T载体后转化DH5α感受态细胞，阳性菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，并拼接获得完整的bro-a和bro-c基因序列1. 5. 3 系统发育进化分析 以舞毒蛾核型多角体病毒（LdMNPV）的bro-a和bro-c基因为外源对照，利用ClustalX和DNAMAN对测序获得的15份BmNPV样品的bro-a和bro-c基因序列进行比对分析并构建系统发育进化树利用GraphPad Prism 6.0对试验数据进行统计分析。
2 结果与分析2. 1 不同蚕区和季节BmNPV毒株对家蚕的感染情况由图1可看出，从不同蚕区和季节采集到的15株BmNPV毒株对家蚕均有一定的感染力，对家蚕的LC50在2.1106～4.2106多角体/mL以在百色蚕区收集的BmNPV感染力相对较弱，其LC50为4.2106多角体/mL;在来宾蚕区收集的BmNPV感染力最强，其LC50为2.1106多角体/mL，二者相差2倍对不同蚕区的BmNPV感染力（LC50）进行方差分析，结果发现均未。