山姜素抑制卵巢癌OVCAR-8细胞增殖迁移及其机制研究

《山姜素抑制卵巢癌OVCAR-8细胞增殖迁移及其机制研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《山姜素抑制卵巢癌OVCAR-8细胞增殖迁移及其机制研究（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、 山姜素抑制卵巢癌OVCAR8细胞增殖迁移及其机制研究 曾静 王璟 殷金凤 宋琦摘要 目的 探討山姜素对人卵巢癌OVCAR-8细胞的增殖、迁移的抑制作用及其可能机制。 方法 以DMSO为溶剂对照，使用不同浓度山姜素（25、50、100、200和400 mol/L）处理OVCAR-8不同时间（24、48和72 h）后，采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖活力；采用3D肿瘤微球形成实验检测50 mol/L山姜素处理7 d后肿瘤微球形成能力；使用划痕实验检测100 mol/L山姜素处理24 h后对迁移能力；采用Western blot法检测不同浓度山姜素（50、100和200 mol/L，以DMSO为对

2、照）作用48 h后OVCAR-8细胞STAT3信号通路及凋亡相关蛋白表达变化。 结果 25400 mol/L山姜素对OVCAR-8细胞增殖均有抑制作用，且呈剂量-时间依赖效应关系（均P 0.05）；50 mol/L山姜素处理组肿瘤微球直径较DMSO组明显减小（P 0.05），而100 mol/L山姜素组划痕宽度明显宽于DMSO对照组（P 0.05）；此外，50、100和200 mol/L山姜素处理组Bax、cleaved-caspase-3和-9的表达明显增加，Bcl-2、p-STAT3、c-myc、survivin蛋白表达明显减少，均呈一定的剂量依赖效应关系（均P 0.05）。 结论 山姜素

3、对卵巢癌OVCAR-8细胞增殖和迁移具有抑制作用，且可能与STAT3信号通路抑制以及线粒体凋亡通路激活相关。关键词 山姜素；卵巢癌；增殖；迁移；微球；凋亡 R711.75 A 1673-7210（2018）04（a）-0013-05Abstract Objective To explore the effect of alpinetin on human ovarian cancer cell line OVCAR-8 and its mechanism. Methods OVCAR-8 cells were treated with different concentrations of a

4、lpinetin （25， 50， 100， 200 and 400 mol/L， DMSO as control） for different hours （24， 48 and 72 h）， then cell viabilities were detected by CCK-8 assays. 3D spheroid assay was used to measure the spheroid formation capacity of OVCAR-8 cell after treated with 50 mol/L alpinetin （DMSO as control） for 7 d

5、ays. Besides， wound healing assay was used to measure the migration capacity of OVCAR-8 cell after treated with 100 mol/L alpinetin （DMSO as control） for 24 h. In addition， Western blot was used to detect the protein levels of STAT3 signaling related and apoptosis related proteins in OVCAR-8 cells a

6、fter alpinetin treatments （50， 100 and 200 mol/L， DMSO as control） for 48 h. Results 25-400 mol/L alpinetin had remarkable inhibiting effects on OVCAR-8 cells and in a dose-and time-dependent manner（all P 0.05）. After 7 days treatment， the diameter of spheroid in 50 mol/L alpinetin group was signifi

7、cantly shorter than DMSO control group （P 0.05）. Besides， the width of wound in 100 mol/L alpinetin group was significantly longer than DMSO control group after treatment for 24 h （P 0.05）. In addition， the protein levels of Bcl-2， p-STAT3， c-myc and survivin were decreased in 50， 100 and 200 mol/L

8、group of OVCAR-8 cells than DMSO control group after 48 exposure. On the contrary， the protein level of Bax， cleaved-caspase-3 and -9 was increased （all P 0.05）. Conclusion Alpinetin can inhibit the proliferation and migration of OVCAR-8 cells，its mechanism may be related to the inhibition of STAT3

9、signaling pathway and the activation of mitochondrial apoptosis signaling.Key words Alpinetin； Ovarian cancer； Proliferation； Migration； Spheroid； Apoptosis卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，也是女性癌症相关死亡的第五大常见原因1。其治疗主要是以铂类药物为核心的化学治疗，近年来化疗药物耐药成为卵巢癌复发和死亡率上升的重要因素，因此发现新的抗卵巢癌药物一直以来都是卵巢癌研究的热点之一。山姜素是提取自草豆蔻根茎或种子的一种天然类黄酮类物质。具有镇

10、痛、抗炎和抗氧化作用2。近年来，国外有研究者将山姜素运用于抗肺癌及消化道等肿瘤的研究中3-7，并证实其抗肿瘤作用，但其对卵巢癌细胞的作用及其机制尚不明确。因此，研究山姜素对人卵巢癌细胞的作用及其分子机制，对抗卵巢癌新药发现具有重要的意义。1 材料与方法1.1 主要试剂和设备山姜素（Alpinetin）购于成都曼斯特生物科技有限公司（A1051，HPLC纯度98%）；RPMI1640培养基、磷酸盐缓冲液（PBS，20012027）、胎牛血清购于美国赛默飞世尔科技有限公司；RAPI裂解液（P0013B）、CCK-8试剂盒（C0038）和BCA试剂盒（P0012）购于碧云天生物技术有限公司；抗GAP

11、DH（2188R）、-actin（0061R）、STAT3（1141R）、p-STAT3（1658R）、c-myc（4963R）、Survivin（0615R）、Bcl-2（0032R）和Bax（20386R）一抗購自北京博奥森生物技术有限公司；抗cleaved-caspase-3（9664）和cleaved-caspase-9（20750）购自美国CST公司；羊抗兔荧光二抗（C40109-04）购于美国LI-COR公司；CO2培养箱为德国BINDER公司产品（BD53型）；倒置显微镜为日本OLYMPUS公司产品（CKX31型）；酶标仪为美国PerkinElmer公司产品（1420型）；电泳电

12、转仪为北京六一仪器厂产品（DYCZ-40D型）；双色红外激光成像系统为美国LI-COR公司产品（Odyssey）。1.2 实验方法1.2.1 细胞培养 人卵巢癌OVCAR-8细胞购于博奥派克生物有限公司（BI0-247），培养于RPMI1640培养基（含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和链霉素100 g/mL），于5%CO2、37恒温培养箱中培养。1.2.2 细胞增殖活力检测 OVCAR-8细胞以3103细胞/孔接种于96孔板，24 h后更换含不同浓度山姜素的培养基100 L。药物浓度分别为25、50、100、200和400 mol/L，以DMSO为溶剂对照组，分别于24、48、72 h

13、更换CCK-8检测试剂100 L（90 L RMPI1640培养基+10 L CCK-8液），于5%CO2、37培养箱中孵育4 h，用酶标仪在450 nm波长检测各孔的吸光度值（A）。实验重复3次。计算细胞增殖活力：细胞活力（%）=（实验组平均A值/对照组平均A值）100%。1.2.3 3D肿瘤微球形成实验 OVCAR-8细胞以3103细胞/孔接种于每孔含5 L胶原蛋白的超低黏附96孔板，24 h后采用倒置显微镜拍照，拍照后加入山姜素（50 mol/L），以DMSO为对照；7 d后再次拍照记录，计算肿瘤微球直径。1.2.4 划痕实验 OVCAR-8细胞以2105细胞/孔接种于六孔板，待细胞长至

14、完全融合后采用200 L枪头在中央划痕，PBS冲洗后采用倒置显微镜拍照；换液后用100 mol/L处理24 h，以DMSO为对照，再次使用倒置显微镜拍照，计算划痕宽度。1.2.5 Western blot 以DMSO为对照，采用不同浓度（50、100和200 mol/L）山姜素处理OVCAR-8细胞48 h，随后使用RIPA裂解液（含1%苯甲基磺酰氟）提取细胞蛋白，使用BCA法测定蛋白样品浓度。以每孔30 L蛋白体系，行10% SDS-PAGE凝胶电泳并电转移至PVDF膜；3%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4摇床孵育过夜；洗膜后加入荧光山羊抗兔二抗室温摇床孵育1 h；洗膜后于双色红外激光成像系统扫描

15、收集荧光信号。以GAPDH或-actin为内参照，采用QuantityOne-v4.6.2软件对Western条带进行定量分析。1.3 统计学方法采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数标准差（xs）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnet t法，组内两两比较采用Tukey法，以P 0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 山姜素对卵巢癌OVCAR-8细胞增殖活力的作用与DMSO对照组比较，采用25、50、100、200和400 mol/L山姜素处理卵巢癌OVCAR-8细胞24、48和72 h后，细胞活力明显下降，增殖受到明显抑制，且呈剂量-时间依赖效应关系，差异均有统计学意义（P 0.05）。见图1。2.2 山姜素对卵巢癌OVCAR-8细胞肿瘤微球形成的影响与DMSO对照组比较，50 mol/L山姜素处理卵巢癌OVCAR-8细胞7 d后，肿瘤微球直径明显减小，差异均有统计学意义（P 0.05）。见图2。2.3 山姜素对卵巢癌OVCAR-8细胞迁移的影响100 mol/L山姜素处理卵巢癌OVCAR-8细胞24 h后，划痕宽度明显大于DMSO对照组，细胞迁移能力明显受到抑制，差异均有统计学意义（P 0.05）。见图3。2.4 山姜