《克必隆B载体MagicVectorB》由会员分享，可在线阅读，更多相关《克必隆B载体MagicVectorB（2页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、克必隆 B 载体MagicVector B 货号:M050016产品及特点：本产品是在克必隆 G 载体的根底上开发的特地用于高效快速克隆平末端 DNA 片段的专用载体,它是由 Sma I 酶切克必隆 G 载体后经过纯化得到的即用型线性载体。跟克必隆 G 载体一样，本产品带有自杀基因，Sma I 位点位于该基因之中，只有当外源平末端 DNA 插入片段插入 Sma I 位点,连接后的 DNA 转化的细胞才能生长,所以最终得到的转化子几乎都是含有平末端 DNA 插入片段的重组子。1. 即用性，可以直接用于连接反响，免去繁琐的酶切，电泳检测，纯化，去磷酸化，再纯化等步骤。2. 具有克必隆-G 载体的全
2、部优点，包括零背景,适用于全部 E.Coli 菌株,多拷贝的 colEI 型复制起始位点。3. 高效率，由于自杀基因的使用有效地减除了载体自身环化对平末端 DNA 克隆的影响，自身环化得到的转化子在有选择液存在时只占总转化子的 1%-5%。4. 应用广泛，可用于克隆酶切产生的平末端 DNA，Pfu 酶扩增的 PCR 片段，cDNA 片段，3”和 5”RACE片段, Taq 酶扩增的PCR 片段(局部为平末端。规格及成分质粒信息克隆位点成份克必隆 B 载体 DNA选择液,1000X 使用手册2 ug 包装2 ug1.5 mL 1 份Not IXba ISpe I(Sma I 位点)740 TGG
3、CGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATT ACCGCCGGCGAGATCTTGATCACCTAGGGGGCCCGACGTCCTTAAHind IIICla ISal IXho I790 CGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCGG GCTATAGTTCGAATAGCTATGGCAGCTGGAGCTCCCCCCCGGGCC运输及保存：4C 运输, -20C 保存，保存期限为 24 个月。使用方法1. 连接反响a. 取新的经过灭菌处理的 0.5 ml Eppendorf 管, 编号。b. 将 100 ng 载
4、体 DNA 转移到无菌离心管中，加两倍摩尔量的外源 DNA 片段，折合成重量(ng) = (外源 DNA 片段 bp 数 X 100 ng X2)/5330 bp (载体 DNA 长度)c. 加蒸馏水至体积为 8 l，于 45保温 5 分钟，使重新退火的粘端解链。将混和物冷却至 0。平末端 DNA 片段的克隆可以省去 45保温 5 分钟这一步。d. 参加 10T4 DNA ligase buffer 1l, T4 DNA ligase 0.5 l，混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底，于 16保温 1-24 小时。e. 同时做只有外源DNA 片段没有质粒载体的组比照反响。没有必要做只有质粒载体
5、而无外源 DNA 的比照组，由于自身环化的载体不能生长, 能够生长的转化子根本上是两个载体分子相互连接形成的新载体。但在有两倍于外源 DNA 片段存在的状况下,两个载体分子连接的机率很小。2. E. coli 感受态细胞的转化a. 各取每组连接反响液 2 l 按标准方法转化 E. coli 感受态细胞。b. 每组连接反响转化原液取100 l用无菌玻棒均匀涂布于筛选培育基上，37下培育半小时以上,直至液体被完全吸取。c. 倒置平板于 37连续培育 12-16 小时，待消灭明显而又未相互d. 重叠的单菌落时拿出平板。假设转化效率为 3 x 107 转化子/gDNA, 10 l 上述连接反响液一般能
6、得到 10,000 个转化子，其中含外源 DNA 片段的重组子约占 90-95%。注:不带有载体的细胞，由于无Amp 抗性，不能在含有选择液的培育基上成活。带有自身环化载体的转化子由于自杀基因表达，不能在含有选择液的培育基上成活。有少数的自身环化载体能够生长是由于其自杀基因发生突变，但只占总转化子数量的 10%以下。带有重组质粒的转化子由于自杀基因被插入片段破坏，能在含有选择液的培育基上成活。此类转化子占总转化子数量的 90%以上。3. 重组质粒的筛选和鉴定a. 快速菌落 PCR 法：b. 用无菌牙签挑取红色单菌落于 100 l 溶菌液中，100水浴 5 分钟，取 5 l 进展 PCR。电泳分
7、析 PCR 产物，扩增片段大小依据引物位置而定。此方法只需半天时间，但需要使用天泽基因特地为快速筛选“克必隆”系列载体重组质粒的相关产品-菌落 PCR 试剂盒Colony PCR Kit。c. 经典酶切质粒法：用无菌牙签挑取红色单菌落接种于含 50 g /ml Amp的 5 ml LB液体培育基中，37下振荡培育 12 小时。小量制备质粒 DNA，酶切后电泳。DNA 片段大小依据酶切位置而定。此方法需要预先知道克隆片段的酶切位点。使用效果图注:1 为 100 ng B 载体自身环化后,转化 E.coli 后在 LB+Amp 上得到的转化子(约 120 个);2 同 1,只是LB+Amp 培育基
8、上涂有诱导自杀基因表达的选择液,只有 1 转化子消灭自杀基因的假阳率低于 1%;3 为 100 ng B 载体与 40 ng 1 kb DNA 片断连接后得到的转化子约 30 个,全部转化子均带有插入片段验证结果未在此显示,阳性克隆占 100%。连接反响总体积为 10 uL, 用 3 uL 与克必隆常态转化液转化 10 个 DE3 菌落，1/10 涂盘后 37 16 小时培育。疑难解答1、 假设外源 DNA 片段太短，又不含终止密码，载体上的自杀基因将不能被打断，得到的含外源DNA 片段的重组质粒转化子将不能生长，能够生长的少数重组子只是自杀基因发生突变的突变子。2、 假设背景较高(有多于 20%的菌落不含重组子), 可能缘由之一是操作过程 DNA 片段的末端被 DNase 破坏, 建议使用新的酶切反响液或连接液;可能缘由之二是选择液失活或浓度偏低，建议更换新的选择液或增加其使用浓度。
