红毛菜28SrDNA和IGS序列分析及系统发育 徐佳杰+姜波+朱建一+何渊+沈宗根摘要：为了探讨中国境内红毛菜的物种关系及亲缘关系，对红毛菜核糖体基因的28S rDNA、IGS序列进行了研究28S rDNA序列分析结果显示：江苏（LYG、NT）、福建（NRD1、NRD2）、广东（NA1、NA2、NA3）的7个海水红毛菜遗传距离为0～0.004；而威海（WH）的海水红毛菜与其他海水红毛菜的遗传距离为0.144～0.147；山西娘子关（NZG）、甘肃兴隆山（XLS）的2个淡水红毛菜之间的关系极近，遗传距离为0.001；淡水红毛菜与威海的海水红毛菜的遗传距离（0.125）小于淡水红毛菜与其他7个海水红毛菜的遗传距离（0.210～0.213）对江苏、福建、广东的7个海水红毛菜的IGS序列进行分析显示，7个海水红毛菜亲缘关系极近基于28S rDNA序列的系统进化树显示，中国境内采集到的红毛菜分为3个进化分支：2个淡水红毛菜形成独立1支，而海水红毛菜则分为2个进化分支，其中威海的海水红毛菜单独为1个分支，其他7个海水红毛菜归为另1个分支由此推测，目前为止中国境内至少存在3种红毛菜关键词：红毛菜；28S rDNA；IGS；分类学： Q968.43+9；S188+.1文献标志码： A：1002-1302（2016）04-0066-04红毛菜（Bangia）属红藻门（Rhodophyta）红藻纲（Rhodophyceae）红毛菜亚纲（Bangiaophycidae）红毛菜目（Bangiales）红毛菜科（Bangiaceae）[1]。
红毛菜的形态极其简单，为直立不分枝的丝状红藻[2]红毛菜在全球的分布极为广泛，从北半球的北欧到南半球的新西兰都有分布[3]，包括海水环境、淡水环境[4]红毛菜的传统分类方法是根据其形态（藻体长度、直径和颜色）、染色体数目、繁殖方式、生活环境和地理分布等特征进行研究[5-6]由于红毛菜形态结构极其相似，且易受栖息环境的影响而发生变化[5]，因此仅依据传统分类学方法已经不能满足红毛菜的分类需求，不少研究者开始从分子水平对红毛菜进行分类研究[7-8]红毛菜核糖体RNA基因序列由18S rDNA、5.8S rDNA、28S rDNA构成1个转录单元，彼此之间被转录内间隔区（ITS1、ITS2）隔开；转录单元之间则被基因内间隔区（IGS）隔开[9-10]核糖体RNA基因序列不同区域由于功能需要不同，承受不同的选择压力而表现出不同的进化速率，如编码区序列（18S rDNA、5.8S rDNA、28S rDNA）具有功能需要，承受较高的选择压力而表现出较慢的进化速率，适用于种属间及以上水平的分类研究[11-12]；非编码区序列（ITS1、ITS2、IGS）则没有功能需要，承受较低的选择压力而表现出较快的进化速率，适用于种属间甚至种下水平的分类研究[13-15]。
Freshwater等根据28S rDNA对红藻的13个物种进行序列分析，结果发现13个物种可以分为11目[11]，由此推测28S rDNA可能更适合用于红藻较高阶元间的系统发育研究Pecchia等对向日葵茎溃疡病菌（Diaporthe helianthi）的18S rDNA 5′端的部分IGS序列进行分析，结果显示：来自阿根廷、法国、意大利、南斯拉夫、罗马尼亚的病菌可以分为3个独立的菌群[16]本研究首次对采自中国沿海地区、内陆地区10个不同采集地的红毛菜进行28S rDNA的分子系统学研究，分析中国境内红毛菜的物种关系同时对江苏省、福建省、广东省的7个海水红毛菜的IGS序列进行分析，以探讨不同地区海水红毛菜间的亲缘关系1 材料与方法1.1 试验材料10个红毛菜采集地分别是山东威海（WH）、江苏连云港（LYG）、江苏南通（NT）、福建莆田南日岛（2个采集地：NRD1、NRD2）、广东汕头南澳（3个采集地：NA1、NA2、NA3）的8个海水红毛菜，以及山西阳泉娘子关（NZG）、甘肃兰州兴隆山（XLS）的2个淡水红毛菜，具体信息见表1将采集到的材料分别用海水、淡水初步清洗后阴干，置于-20 ℃保存备用。
1.2 DNA的提取采用CTAB法对采自不同地理群的红毛菜进行DNA提取[17]，通过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的完整性，置于-20 ℃保存备用1.3 PCR扩增引物序列如表2所示，PCR引物由苏州金维智生物科技有限公司合成PCR反应体系为50 μL，包括：5 μL 10LA Taq PCR Buffer Ⅱ（Mg2+Plus），5 μL dNTP Mixture （2.5 mmol/L），2 μL DNA模板，各1 μL上、下游引物（20 μmol/L），0.5 μL LA Taq（5 U/μL），35.5 μL ddH2OPCR反应条件为：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 7 min1.4 克隆与测序PCR扩增产物经凝胶电泳检测后，采用试剂盒切胶回收，将回收的目的片段与pEASY-T3载体连接，于25 ℃连接15 min然后将连接产物导入Trans1-T1感受态细胞，冰浴30 min，热激30 s，再冰浴2 min完成连接转化后，加LB液体培养基于37 ℃摇菌复苏，然后均匀涂抹在LB固体培养基上，37 ℃恒温培养过夜。
最后挑选阳性克隆样品送苏州金维智生物科技有限公司进行测序1.5 序列分析通过NCBI中的BLAST软件对测序获得的序列与GenBank 中的序列进行同源性比对，以确定其为正确序列用DNAMAN软件对样品进行多序列比对，手工调整个别碱基通过MEGA6.06软件计算序列两两之间的遗传距离并构建ML系统进化树[18]，自举重复数为1 000，其他参数均为默认值系统进化树所用到的序列名称和登录号见表3 2 结果与分析2.1 28S rDNA、IGS序列的PCR扩增以 ITS-LF/LR1为引物，连云港（LYG）、南通（NT）、南日岛1、南日岛2（NRD1、NRD2）、南澳1、南澳2、南澳3（NA1、NA2、NA3）的海水红毛菜基因组DNA为模板，均成功扩增出1条大小约2 100 bp的目的条带（图1-a）以威海（WH）的海水红毛菜基因组DNA为模板，扩增获得的PCR产物为单一明亮条带，大小约为2 000 bp（图1-b）以I2LF/I2LR为引物，娘子关（NZG）、兴隆山（XLS）的淡水红毛菜基因组DNA为模板，扩增获得大小约2 400 bp的单一明亮条带（图1-c）以 IGSF1/IGSR1为引物，海水红毛菜（除WH以外）基因组DNA为模板，扩增获得的PCR产物为单一明亮条带，大小约为1 600 bp（图1-d）。
在NCBI中进行比对，确定其为红毛菜的28S rDNA序列，剪去上游5.8S rDNA、ITS区序列后，获得不同地理群红毛菜的28S rDNA序列长度分别为：威海（WH）的海水红毛菜为1 514 bp，其他7个海水红毛菜均为1 541 bp，淡水红毛菜均为1 855 bp江苏省、福建省、广东省的7个海水红毛菜扩增获得的IGS序列与福建莆田的海水红毛菜IGS序列（KR010939）比对后，相似性极高，约为99%，因此确定它们为海水红毛菜的IGS序列，且不同地理群海水红毛菜的IGS序列长度为1 645～1 646 bp2.2 不同地理群28S rDNA、IGS序列的比对分析将不同地理群测序获得的28S rDNA序列比对后，对齐剪切，用MEGA 6.06生物信息学软件计算序列的遗传距离由表4可见，在海水种群中，连云港（LYG）、南通（NT）、南日岛2个品种（NRD1、NRD2）、南澳3个品种（NA1、NA2、NA3）的7个海水红毛菜之间遗传距离为0～0.004，其中连云港（LYG）、南澳1（NA1）、南澳3（NA3）的28S rDNA序列相同威海（WH）的海水红毛菜与其他采集点的7个海水红毛菜之间的遗传距离为0.144～0.147。
娘子关（NZG）、兴隆山（XLS）的2个淡水红毛菜之间的遗传距离为0.001淡水红毛菜与海水红毛菜之间的遗传距离较远，其中与威海（WH）的海水红毛菜的遗传距离为0.125，与其他7个海水红毛菜的遗传距离为0.210～0.213根据上述结果分析，初步推测连云港（LYG）、南通（NT）、南日岛2个品种（NRD1、NRD2）、南澳3个品种（NA1、NA2、NA3）的海水红毛菜为1个类群，进而采用进化速率较快的IGS序列对这些地理群的海水红毛菜进行分析，结果见表4可以看出，采自江苏省、福建省、广东省的7个海水红毛菜的IGS片段序列遗传距离极近，为 0～0.003，其中连云港（LYG）、南通（NT）的IGS序列相同2.3 基于28S rDNA序列构建的系统进化树由于GenBank中已有的红毛菜科28S rDNA序列较少，且仅有的几个紫菜序列也只是28S rDNA上游序列，因此选取长度适宜的紫菜28S rDNA序列与本研究中的红毛菜28S rDNA上游序列进行系统进化树的构建石花菜目Capreolia implexa（AF039545）为外类群，系统进化树见图2可以看出：连云港（LYG）、南通（NT）、南日岛2个品种（NRD1、NRD2）、南澳3个品种（NA1、NA2、NA3）的7个海水红毛菜归于1个进化分支，置信度为100%；威海（WH）的海水红毛菜单独归于1个大分支上；8个海水红毛菜与紫菜聚类为1支，为2个淡水红毛菜的姐妹分支；娘子关（NZG）、兴隆山（XLS）的淡水红毛菜则归为另1个分支，置信度为100%。
3 讨论与结论3.1 28S rDNA序列遗传距离和系统进化树分析国内外关于28S rDNA序列应用于物种分类与进化的研究相对较少，仅有几位研究者对红藻不同物种的28S rDNA进行研究Freshwater等报道了石花菜目中16个石花菜物种的28S rDNA序列差异度小于rbcL且大于18S rDNA的差异度，介于两者之间，发现其研究价值不亚于18S rDNA、rbcL序列[11，21]Harper等研究珊瑚藻28S rDNA序列时曾推测，28S rDNA序列具有区分亲缘关系较近的物种的潜能[22]从本研究数据中可以看出，不同物种间28S rDNA上游序列的遗传距离为0.125～0.213，显然28S rDNA序列在种间及种以上水平的分类鉴定能力较好，验证了Harper等的推测：28S rDNA 具有区分鉴定亲缘关系较近的相关物种的潜能，在未来具有较大的发展前景[9]根据红毛菜28S rDNA上游序列比对分析后，10个地理群的红毛菜大致分为3个类群结合GenBank中已有的紫菜28S rDNA序列构建系统进化树，结果显示，10个地理群红毛菜分为3个进化分支：其中连云港（LYG）、南通（NT）、南日岛2个品种（NRD1、NRD2）、南澳3个品种（NA1、NA2、NA3）的7个海水红毛菜归为1个分支；而威海的海水红毛菜则与其他7个海水红毛菜差异较大，独立归为1个大分支，显示了海水红毛菜的多样性；娘子关（NZG）、兴隆山（XLS）的2个淡水红毛菜则单独归为1个分支，且与海水红毛菜存在明显差异。
3.2 IGS序列遗传距离分析有研究报道，在种内及种间系统进化分析中，IGS序列的变异率高于ITS1、ITS2[9，23]，一般用于亲缘关系较近的物种或者种内分析先后有多位研究者对不同物种的遗传多样性等方面进行研究[24-26]Li等对采自莆田、汕头、宁波3个产地的栽培坛紫菜的部分IGS进行分析，在1 085～1 100 bp的序列中存在55个变异位点，即约5%的变异率，因此推测IGS可以作为红藻种内研究的分子标记[27]根据红毛菜核糖体基因28S rDNA序列分析结果及系统进化树，可。