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1、虫草提取物减轻细胞氧化损伤作用顾宇翔1，李素霞2,庞怀宇2,袁勤生上海质量监督技术检验研究院，上海200233,华东理工大学生物工程学院，上海200237；由于口前人们对化学合成抗氧化药物（如BHT等）的副作用和毒性反应H 益担忧，天然抗氧化剂正越来越受到人们偏爱。虫草作为一种名贵的小药、它所 特有的药用价值已被普遍证实，但尚没有查阅到山草减轻细胞氧化损伤方而的报 道。本工作以过渡金属离子Fc2+作为自由基产生的来源考察了天然冬虫夏草、蛹 虫草及其发酵菌丝体的水和醇提取物减轻细胞氧化损伤的作用。Fc?+既是生物体 所必须的过渡金属离子，是体内许多酶的金屈辅基，具有重要的生理学作用；但 同时它也
2、能催化产生具有细胞毒性的氧自由基并诱导脂质过氧化反应。1实验材料天然冬虫夏草IConlyceps sinensis）采自四川省，天然蛹虫草（Corclyceps militaris）采于辽宁省沈阳市辉山。人肝癌细胞株SMMC-7721 （第二军事医 学院）;人肺癌细胞株95D （华东理工大学药学院）；2方法2.1虫草提取物减轻金属离子诱导的95D细胞氧化损伤2.2虫草提取物提升胞内SOD和CAT水平胞内SOD和CAT水平的测定分为两组：（a）不加入0.01 mmol/L H2O2和50 gmol/LFe2+,只加样品（10-50 gg/ml）的组，此组设有不加样品的空白。（b）加 入含 0.0
3、1 mmol/L H2O2 50 gmol/L Fe2 样品或茶多酚（10-50（ig/ml）的组，此 组设有只加H2O2和FeS不加样品的对照。超氧化物歧化酶活力测定：联苯三酚自氧化法”9】。过氧化氢酶活力的测定按照文献”叫一个酶活力单位（U）定义为在25 C, 50 mM磷酸缓冲液中（pH 7.0）,每分钟分解一个微摩尔过氧化氢所需要酶的量, 以U/mg蛋白质表达。其中过氧化氢在240 nm处的消光系数定为43 mol/ （LX cm） o2.3其它抗氧化指标的测定虫草提取物减轻自由基对细胞生长的损伤、抑制金属离子诱导的细胞脂质过 氧化和降低胞内ROS水平，并以茶多酚作为抗氧化活性对照品。
4、3结果3.1虫草提取物减轻活性氧和自由基对细胞生长的抑制虫草及其制品的提取物能够缓解自由基引起的生长抑制（见图1）,并且细 胞的量与加入样品的剂量大致成正比。其中以50 iLig/ml天然蛹虫草和冬虫夏草 的水提取物组的细胞存活率最接近空白组，与抗氧化对照品茶多酚的作用相似。120Blank Control CCSW CCSE CCMW CCME NCSW NCSE NCMW NCMETeapolyphenol90)030图1虫草提取物减轻过氧化氢对95D细胞生长的抑制CCSW：冬虫夏草菌丝体水提取物；CCSE：冬虫夏草菌丝体醇提取物；CCMW：蛹虫草菌丝 体水提取物；CCME：蛹虫草菌丝体醇
5、提取物；NCSW:冬虫夏草水提取物；NCSE：冬虫 夏草醇提取物；NCMW：蛹虫草水提取物；NCME：蛹虫草醇提取物。浅色带：10 pg/ml；灰色带：30 Lig/ml；深色带：50 Lig/mlo3.2虫草提取物对细胞脂质过氧化的抑制作用加入F+和H2O2的对照组比空口组的TBRAS值有很大的上升，从1.59 gmol/106个细胞变为4.07 gmol/106个细胞（见图2）。除发酵冬虫夏草菌丝体外, 各样品的加入都可以明显降低脂质过氧化值，而且降低的量与加入的剂量基本呈 正比。在8种提取物中以天然蛹虫草降低的TBRAS值最多，不但多于茶多酚， 更使其TBRAS水平接近于正常状态下的细胞
6、。在10、30和50 yg/ml用量时它 的TBRAS值分别为2.38、1.85及1.41中“01/1（）6个细胞。总体上说，天然虫草提 取物抑制脂质过氧化的效果比发酵菌丝体要好，而蛹虫草TBRAS降低的值比相 应的冬虫夏草要多。6.04.53.0L50.0Blank Control NCSW NCSE NCMW NCME CCMW CCMETeapolyphenol图2虫草提取物对95D细胞脂质过氧化的抑制作用描述同图1。冬虫夏草发酵菌丝体水和醇提取物对TBRAS值没有明显影响（P0.05）,故没有列出。3.3虫草降低胞内ROS水平的作用Fe?十和H2O2诱导的氧化损伤使细胞内ROS的量极大
7、增加，对照组的DCF荧光 值是空白组的4倍多。样品清除ROS的能力呈现与剂量成正比的提高，尤其在天 然蛹虫草的水和醇提取物中表现的更为明显，而且除此两组以外，其它样品的 DCF荧光值都耍显著高于相应浓度的茶多酚。蛹虫草提取物清除胞内ROS的能力 要强于相应的冬虫夏草，各组样品水提物和醇提物清除胞内ROS能力的差异并不 显着。天然虫草提取物的效果要好于相应的发酵菌丝体，其中又以发酵冬山夏草 菌丝体提取物的效果最差，与对照组相比其DCF荧光值仅由369下降到了50 Mg/ml 剂量时的322和301。图3虫草提取物降低95D细胞胞内ROS水平的作用 有关描述同图2。3.4虫草提高胞内SOD和CAT
8、活性的作用作为胞内重要的抗氧化酶，超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT） 的活性也是衡量细胞氧化还原状态的重耍标志。数据表明虫草提取物确实对 SOD和CAT的活性的提升具有一定促进作用。正常培养条件下各样品对SOD 和CAT活性的影响很小，即使在最人浓度50 pg/ml吋也仅有天然虫草的水提取 物、发酵蛹虫草菌丝体的醇提取物这三组的SOD和CAT活性有一定上升，和空 白组存在显著性差异（戶0.05）。在Fe?+和H2O2诱导的氧化压力之下对照组中 SOD和CAT活性降低了不少，而虫草提取物的加入能使其酶活下降幅度减小， 但尚不能使细胞回复到正常的状态。天然蛹虫草的水提取物在所有组表现出
9、了最 强的提高胞内SOD和CAT活性的作用，与抗氧化对照品茶多酚的效果相差不多。 值得注意的是，在之前的一系列实验中抗氧化活性最低的冬虫夏草菌丝体对于促 进这两种抗氧化酶活力的上升有着比较明显的作用，在SOD酶活上表现得更为 明显。它的效果超过了天然冬虫夏草，接近丁天然蛹虫草提取物。4讨论实验选用的自由基诱导物过氧化氢和亚铁离子能在一定的条件下生成疑自 由基等活性氧。疑自由基是生物体内最活泼的自由基，它能捕获与氨基酸相连的 碳上的氢原子，形成以碳原子为中心的蛋口质自由基并叮以和不饱和脂肪酸形成 的脂质自由基，使脂质产生过氧反应，从而危害细胞的存活。虫草提取物的抗氧化活性主要来源于它能够降低胞内ROS的量并提升SOD 和CAT等抗氧化酶的活性。虫草提取物所表现出的多种休外抗氧化活性，推测它 能通过清除胞内的过氧化氢、螯合金属离子来减少诸如帑自由基生成的量，对于 已产生的各种氧自由基也可以具有一定的清除作用；同时它可以阻止活性氧对 SOD和CAT这两种蛋白的氧化损伤，进而使它们能正常发挥作用，清除胞内的超 氧自由基和过氧化氢。通过以上途径，虫草使细胞减轻了所受到的氧化损伤，缓 解了氧化压力对其生长和代谢的抑制作用，使细胞在添加氧化剂的环境中也能继 续存活甚至正常生长。
