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1、遗传病检测新技术在儿童神经系统疾病的应用,福建省妇幼保健院儿科 周有峰,遗传病检测技术,第一代测序技术 ： Sanger测序法 ：Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。,遗传病检测技术,Sanger测序法 优点：方法简便，分辨率高，测序片段长 缺点：逐个测序，费时费力,遗传病检测技术,第二代测序技术（“Next-generation” sequencing technology ）： 优点： 速度快、
2、通量高、测序费用相对低 目前主要包括： (1)全基因组测序(whole genome sequencing) (2)全外显子测序(whole exome sequencing，WES) (3)疾病靶向序列测序技术(disease target sequencing，DTS),第二代测序技术,全基因组测序(whole genome sequencing)： 对某种生物的基因组中的所有基因进行测序，真实反映整个生物体的全部遗传信息,第二代测序技术,全外显子测序(whole exome sequencing，WES) 利用目标序列捕获技术对基因组的全部外显子实施捕获并进行高通量测序的一种技术 。 优
3、点：成本更低、测序周期更短、数据分析更方便 缺点：无法了解到内含子区等非编码序列是否发生改变，从而无法全面了解基因组的情况,第二代测序技术,疾病靶向序列测序技术(disease target sequencing，DTS)： 是应用最广泛的利用二代测序的临床诊断方法 优点 ： 按需定制 ，即与某一类疾病(如癫痫)、临床表型(如共济失调)相关的所有致病基因可以被整合到一个基因测序包中进行高通量测序，特别适合临床遗传性病因异质性强的疾病。 目标区域更加集中，测序成本进一步降低，测序和数据分析的周期进一步缩短，从而更加经济、快捷 可以提前到临床诊断之后，神经生化、神经病理等之前进行,第二代测序技术,
4、疾病靶向序列测序技术（DTS）： 缺点： 不能检测未知的致病基因； 所纳入的基因需不断更新，好的DTS检测包应定期更新纳入基因 可能因为设计缺陷导致纳入的已知基因不全面(比如检索的不全面等)，而导致关键遗传信息的遗漏,第二代测序技术,疾病靶向序列测序技术（DTS）： 神经系统疾病适应症：癫痫、智力障碍、先天遗传代谢病、线粒体病、共济失调、遗传性痉挛性截瘫、神经肌肉病等。,拷贝数检测技术,微阵列比较基因组杂交(array-based comparative genomic hybridization，aCGH) 多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent pr
5、obe amplification，MLPA),拷贝数检测技术,微阵列比较基因组杂交(aCGH) 在芯片上应用携带有不同荧光素的病例样本和正常对照样本进行共杂交，以此发现病例样本基因组相对于正常对照样本基因组的DNA拷贝数变化(copy number variation，CNV) 优点： 单次检测所需DNA样本量极少 分辨率高(最好的aCGH可以精确到最小2kb的CNV) 检测周期短(7-10 d) 无需细胞培养 多种样本类型(如外周血标本、培养的细胞、组织标本等)均可以进行检测,拷贝数检测技术,微阵列比较基因组杂交(aCGH) 缺点： 不能检测2kb的DNA片段重复或缺失 价格问题,微阵列比
6、较基因组杂交(aCGH),拷贝数检测技术,多重连接探针扩增技术(MLPA) 应用探针与目的DNA序列进行杂交，通过连接、PCR扩增、产物电泳分离及数据收集等步骤对目的DNA序列进行定性和半定量分析的检测技术 。 优点： 针对已知的DNA小范围的CNV检测，经济高效 特异性高，可明确基因是否重复或缺失 试验周期短 操作方便 缺点：一次检测的区域范围有限，远小于aCGH，不能覆盖整个基因组,合理选择检测新技术,临床明确已知单一致病基因的神经遗传病，可用一代Sanger测序直接进行致病基因检测 。如：Dravet综合征 （SCN1A基因） 临床只能做出表型诊断、病因异质性强的神经遗传病，宜采用二代测
7、序技术的疾病靶向测序基因包 。如：早发性癫痫脑病、非综合征性癫痫伴智力障碍性疾病、遗传性共济失调等 。 临床鉴别诊断困难的神经遗传病：特异性靶向测序基因包 临床怀疑CNV所致疾病：如果致病基因明确，可直接用MLPA方法 （如如佩梅病的PLP1基因、Dravet综合征的SCN1A基因 ）,合理选择检测新技术,致病基因和(或)CNV位点众多，可直接用aCGH 。（智力障碍、孤独症等发育障碍性疾病 ） 临床怀疑染色体病：如有多发小畸形、先天性心脏病及智力障碍等，可以先进行高分辨率染色体核型分析，阴性者再进行aCGH检测。经济条件允许 ，也可直接行aCGH检测。,正确解读遗传学检测结果,判断遗传变异是
8、否是致病性的 已报道的致病性突变，而且临床表型及遗传方式也符合的，可以确诊 。 未报道的新突变的判断： 突变对蛋白结构和功能可能有明显影响：例如移码、无义和剪接位点突变 。 位于高度保守区、导致的氨基酸变异大的错义突变 非已知的单核苷酸多态性(SNPs) ：查询SNPs数据库，或者在大规模正常对照中检测此变异 疾病易感性分离： a、常染色体显性遗传病的新生突变(de novo) b、常染色体隐性遗传病，患者的两个等位基因上均发现了致病突变 c、X连锁隐性遗传病，男孩发病(病情重)，突变为新发或者来自母亲,遗传病的类型,染色体病 单基因病 多基因病 线粒体遗传病 体细胞遗传病：肿瘤,常染色体显性
9、遗传病 常染色体隐性遗传病 X连锁显性遗传病 X连锁隐性遗传病 Y连锁遗传病 线粒体病,神经遗传病临床分类,遗传病的临床分类,遗传代谢病：有机酸代谢病、氨基酸代谢病、脂类代谢病等 遗传变性病 主要累及灰质的灰质脑病（Menkes病、Alpers病、神经元蜡样质脂褐质沉积病等） 主要累及白质的遗传性白质脑病（肾上腺脑白质营养不良、异染性脑白质营养不良、佩梅病等） 遗传性非进展性脑发育障碍疾病：如一些染色体异常导致的智力障碍性疾病,基因诊断的意义,明确患儿的致病基因 了解本家族的致病基因传递状况 遗传咨询和产前诊断 对于不明基因的疾病筛选致病基因 对全人类的贡献,名词解释,单核苷酸多态性(SNPs
10、) ： 是当基因组序列一个单核苷酸（A、T、C或G)发生改变的DNA序列变异。一个SNP必须至少在1%的人群发生才能称之为多态性。 错义突变： 点突变发生在基因编码区，通过改变核苷酸三联密码子导致氨基酸改变，从而改变基因产物功能。 无义突变： 突变导致产生一个提早出现的终止密码子 RNA剪切突变： 围绕内含子周围的剪切位点高度保守，关键核苷酸突变往往影响剪切效率 剪切突变的作用： 使已存在的剪切位点失活； 改变剪切的给位，分支位和受位点，导致剪切失败，可产生大的核苷酸插入或创造新位点。,3UTR,5UTR,GTAG法则,GT,AG,AG,GT,ATG,TAA TAG TGA,mRNA,c.1A
11、 c.150C,RNA加工,名词解释,移码突变（frame-shift mutation） 插入或缺失碱基对导致读码顺序发生移动，从而改变其遗传信息 动态突变 基因的编码区或非编码区的三核苷酸重复序列,如(CAG),(CGG),拷贝数变化,超过了正常范围,GGTCACCTCACGCCA CCAGUGGAGUGCGGU Pro-Arg-Glu-Cys-Gly,Normal gene GGTCTCCTCACGCCA CCAGAGGAGUGCGGU Codons Pro-Glu-Glu-Cys-Gly Amino acids,67,81,23,27,c.71TA (p.Glu24Arg),67,81
12、,23,27,GGTCTTCTCACGCCA CCAGAAGAGUGCGGU Pro-Glu-Glu-Cys-Gly,c.72CT (p.Glu24Glu),GGTCTCCTCACTCCA CCAGAAGAGUGAGGU Pro-Glu-Glu-STOP,67,81,23,c.78GT (p.Cys26X),Mutations: Additions,Normal gene GGTCTCCTCACGCCA CCAGAGGAGUGCGGU Codons Pro-Glu-Glu-Cys-Gly Amino acids,Addition mutation GGTGCTCCTCACGCCA CCACGA
13、GGAGUGCGGU Pro-Arg-Gly-Val-Arg,（A frame shift mutation）, 2010 Paul Billiet ODWS,Mutations: Deletions,Normal gene GGTCTCCTCACGCCA CCAGAGGAGUGCGGU Codons Pro-Glu-Glu-Cys-Gly Amino acids,Deletion mutation GGTC/CCTCACGCCA CCAGGGAGUGCGGU Pro-Gly-Ser-Ala-Val,(A frame shift mutation),单基因病,常染色体显性遗传病 常染色体隐性遗
14、传病 X连锁显性遗传病 X连锁隐性遗传病 Y连锁遗传病 线粒体病,单基因病分类,常染色体显性遗传(AD),致病基因位于122号染色体上，杂合时即可发病 患病由亲代传来，1/2患病机会，连续几代都有,常染色体隐性遗传（AR） 双亲正常，为何生出有遗传病的患儿？,致病基因位于122号染色体上，纯合时才发病 患病由杂合亲代传来，1/4、1/2与1/4患病机会,X染色体显性遗传,致病基因位于X染色体上，杂合时即可发病 女性杂合+正常男性，子女中1/2发病 男性患者+正常女性，儿子正常，女儿发病,X染色体隐性遗传（PMD） 为何男孩发病，女孩“不发病”？,致病基因位于X染色体上，杂合不发病，男多于女 双
15、亲无病时，男性1/2患病机会，女性1/2携带者,AD结果的判读,情况1,情况2,AD结果的判读,情况1,情况2,诊断,家族（+）,家族（-）,诊断,不能诊断,AR结果的判读,情况1,情况2,情况3,情况4,AR结果的判读,情况1,情况2,情况3,情况4,诊断,诊断,诊断,不能诊断,GJA12 c. 216delGinsAA A: 正常对照 B: 患儿 C: 患儿之父 D: 患儿之母,临床和MRI 表现初步诊断为佩梅病,PLP1 gene 测序与MLPA: 正常,GJA12 gene 突变分析 c.216delGinsAA(p.L73fsX106),父母来源: 父亲杂合 母亲为野生型,非孟德尔遗
16、传现象,单体型与等位基因型分析: GJA12 基因突变为1号染色体父源单亲二倍体所致,XR结果的判读,情况1,情况2,情况3,XR结果的判读,情况1,情况2,情况3,诊断,诊断,不能诊断,Menkes病例,男，9月，G3P1（前两胎为自然流产），先兆流产 20d腹沟沟斜疝，2m双侧髋关节脱位 3m抽搐， 呈简单局限性发作， 进行性加 重,脑电图提示高峰失律 智力运动发育迟缓 头围 4 1 c m， 高腭弓, 皮肤 白皙 ， 头发干枯、 发黄、 卷 曲， 以双侧颞 部明显， 双侧腹股沟斜疝， 肌 张力低下， B a r b i n s k i征 阳性 血清铜 为 0.8 mo l L ( 9.4-26.6 ）， 血浆铜蓝蛋白为 5 2.2 m g L (210-530) MRA 脑血管“螺丝锥”样改变,ATP7A c.3045delT（p.T1016fsX1018）,ATP7A IVS18+1 GA （c.3658+1GA ）de novo,患儿,父亲,母亲,突变性质的确定,检测到基因的改变,是已知突变,是否为已报道突变,否，未报道,Exon碱基的改变,内含子碱基的改变,是否改变氨基酸,
