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1、微生物发酵工程实验 中南民族大学工商学院 环境与生物工程实验教学中心,1,实验四、淀粉酶的固定化生产,一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料 四、实验步骤 五、实验结果 六、注意事项 七、思考题,2,学习细胞固定化的原理，通过海藻酸钠包埋固定产淀粉酶的酵母，掌握菌体包埋固定的基本方法，了解固定化细胞在实际中的应用。,一、实验目的,3,细胞固定化技术： 固定化细胞就是被限制自由的细胞。即采用物理或化学的方法将细胞固定在载体上或限度在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并能反复或连续使用。,二、实验原理,游离细胞 固定化细胞,4,最令人感兴趣的是固定化增殖细胞，因为多数微生物代谢的产物与其生长
2、相关。,微生物在固定化后以其生长状态可分为3类： 固定化死细胞； 固定化活细胞（休眠状态）； 固定化增殖细胞（生长状态）。,5,微生物细胞的固定化方法有： （1）吸附法， （2）包埋法， （3）不用载体法。,包埋法,6,7,本实验采用凝胶包埋的固定化方法，把酵母细胞悬浮在海藻酸钠溶液中，再滴加入CaCl2溶液，形成海藻酸钙凝胶小球，细胞包埋在凝胶的小孔中，制成固定化细胞。,8,三、实验材料,1. 酵母菌细胞：面包酵母。 2.培养基： 发酵培养基：葡萄糖：4%；蛋白胨：1%；磷酸二氢钾：0.5%；七水硫酸镁：0.2%酵母膏：0.5%，pH：5.5-6.5。 固定化培养基：淀粉：2；葡萄糖：0.5
3、%；蛋白胨：1%；磷酸二氢钾：0.5%；七水硫酸镁：0.2%；酵母膏：0.5%，pH：5.5-6.5。 3. 海藻酸钠溶液及交联剂CaCl2溶液。,9,四、实验步骤,（一）培养基灭菌 取250ml三角瓶，分别放入配好的液体培养基 100ml，灭菌冷却。 （二）种子活化和接种 酵母菌接入培养基，25培养活化，取活化后的酵母菌分别接入已灭菌冷却的三角瓶培养瓶，振荡混匀。,10,（三）培养 将已接种的三角瓶培养液置于振荡培养箱，200r/min，25培养，离心收获菌体并用无菌水洗涤一次，制备菌悬液，使其中酵母菌数为数量级107个/ml。 （四）海藻酸钠及交联剂的制备 海藻酸钠溶液的制备：取海藻酸钠1
4、.5g，2.0g，2.5g，3.0g，3.5g，分别置于250ml三角瓶中，各加入100ml蒸馏水，放置并搅拌，灭菌。 交联剂的制备：配制2%浓度的CaCl2，灭菌。,四、实验步骤,11,（五）固定化酵母的制备 将酵母湿细胞与20ml海藻酸钠溶液混合均匀； 用注射器（不用针头）将海藻酸钠酵母菌混 合液点滴滴入CaCl2溶液中，形成球状颗粒； 常温下静置2h，使其充分固化； 滤出凝胶颗粒；用无菌水洗涤23遍，即得固定化酵母细胞。,四、实验步骤,12,（六）固定化酵母的增殖 将固定化颗粒投入增殖培养基中进行增殖， 25、200r/min下增殖48h，观察固定化细胞的大小。,四、实验步骤,13,（1
5、）海藻酸钠的浓度对固定化效果的影响。 （2）利用DNS法检测培养液中葡萄糖浓度，以确定是否产生了淀粉酶，经过一段时间培养，滴入碘液，看是否有蓝色产生。,五、实验结果,14,1.加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一环，涉及到实验的成败，一定要按照要求进行操作。海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少，影响实验效果。,六、注意事项,15,2.刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法。一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。,六、注意事项,16,七、思考题 （1） 固定化细胞发酵与流离细胞发酵比较，有哪些优点，在实际应用中存在哪些问题？ （2）试说明以海藻酸钠为载体，以CaCl2为交联剂的凝胶机理？,17,
