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1、海南大学农学院专业实验技能课程实验报告姓名：李成梁学 号： 12071010210009年级：12专 业：生物化学与分子生物学 导 师：陈惠萍教授序号实验名称成绩1水稻糊粉层的剥取902水稻糊粉层总RNA的提取903反转录成cDNA804期终成绩87水稻糊粉层的剥取一、实验目的剥取水种子的糊粉层，为提取水稻糊粉层总RNA做准备二、实验材料：水稻优皿128种子三、实验药品和器材：1%高锰酸钾溶液无菌水DEPC水 灭菌后的培养皿、解剖针、解剖刀、滤纸 无菌操作台四、实验方法与步骤1、用灭菌后的培养皿盛30粒种子，用1%高锰酸钾溶液对种子 消毒10分钟后用无菌水冲洗3遍，倒入DEPC水。2、在无菌操
2、作台上对材料种子去头去尾、保留中间部分，放入 恒温培养箱培养72小时。2、把装有材料的培养皿转移至无菌操作台上，剥取谷売后剥取糊粉层。五、结果与分析可以获得较好的水稻优皿128种子的糊粉层水稻糊粉层总RNA的提取一、准备试剂（3巯基乙醇，液氮，研钵，无RNase离心管，5 M NaCI ,氯仿， 异丙醇，乃乙醇，无RNase水（DEPC水丄二、方法步骤1 ,取不多于o.l g冷冻的研磨过的植物组织（15片糊粉层）， 加0.5 ml提取试剂（4C ），振荡至彻底混匀。冰上平放放置5 min。2 , 4OC 12, 000 rpm 离心 1 min （ 2min ）,上清（约 400ul ）转入
3、新的无RNase离心管,加入0.1 ml 5 M NaCI ,温和混匀。3 ,加入0.3 ml氯仿，上下颠倒混匀，4C 12,000 rpm离心10 min ,取上层水相（约300ul ）转入新的无RNase离心管。注意：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可重复步骤5、6 次（离心时间15min X4 ,加与所得水相等体积的异丙醇（约150ul）,混匀，室温放置 10 mino5 , 4C 12,000 rpm离心10 min。弃掉上清，注意不要倒出沉淀。 加1 ml乃乙醇。（沉淀可能很难看见，应小心操作。）6 , 4C 5,000 rpm离心3 min。倒出液体，注意不要倒出沉淀。 剩余的少量
4、液体短暂离心，然后用枪头吸出，室温晾干2-3 min。7 ,加50 pi无RNase水（DEPC水），反复吹打、混匀，充分溶 解RNA。如有絮状物，可在室温条件下12,000 rpm离心1 min , 取上清转入干净的无RNase离心管中，-70C保存。三、结果与分析获得的产物经琼脂糖凝胶电泳验证可用于后续的RT-PCR反转录成CDNA一、实验材料已获取的水稻优皿128种子糊粉层二、实验药品FastQuant cDNA第一链合成试剂盒（去基因组）三、操作步骤50 ng-2 |Jg总RNA可建立20 pi反应体系。1. 将模板RNA在冰上解冻；5xgDNA Buffer、FQ-RT Primer
5、 Mix、 lOxFast RT Buffer、RNase-Free ddH20在室温（15-25C ）解冻， 解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离 心以收集残留在管壁的液体。（以下操作步骤请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性， 进行各项反应时，应先配制成Mix，然后再分装到每个反应管中。）2. 按照表1的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简 短离心，并置于42C ,孵育3 min。然后置于冰上放置。表1 gDNA去除反应体系SxgDNA Buffer2 MlTotal RNA-8 piRNase-Free ddH20补足到 10 |Jl (0|Jl)表2反转录反应体系lOxFast RT Buffer2 MlRT Enzyme Mix1 piFQ-RT Primer Mix2 PlRNase-Free ddH2O补足到10 |Jl4.将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分 混匀。5.42C ,孵育15 min。6. 95C ,孵育3 min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实 验，或低温保存。、实验结果用试剂盒通常能够获得较好的cDNA
