酵母单杂交是在酵母双杂交的基础上，20世纪90年年代中期又发展 起来的--用于核酸和文库蛋白之间的研宄在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系统中采用的BD-X蛋白 质杂交体，而用特异的DNA序列取代DNAGal4结合位点将己知的特定顺式作用原件构建到最基本启动子(Pmin)上游，把报 告基因连接到Pmin下游编码待测转录因子6^人与己知酵母转录激活结构域(AD)融 合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够和顺式作用原件结 合，就能激活Pmin启动子，使报告基因得到表达转录因子与顺式元件结合，激活最基本启动子Pmin,使报告基因表 达，若连接如3个以上顺式作用元件，可增强转录因子的识别和结合 效率优点：简单易行，无需分离纯化蛋白，酵母菌属于真真核生物，杂交 体系检测到的与DNA结合的蛋白质是处于自然构象克服了体外研究 时蛋白通常处于非自然构象的缺点，因而灵敏性很高缺点：有时由于插入的靶元件与酵母内源转录激活因子可能发生相互 作用，或插入的靶元件不需要转录激活因子就可以激活报道基因的转 录，因而存在假阳性结果如果酵母表达的AD杂合蛋白对细胞有毒性或者融合 蛋白在宿主细胞内不能稳定的表达，或者融合蛋白发生错误折叠，或 者不能定位于细胞核内，以及融合的GAL4-AD封闭了蛋白上与DNA 作用的位点则都可能干扰AD杂合蛋白结合于靶元件的能力，从而产 生假阴性的结果。
酵母单杂交系统应用：1.鉴别DNA结合位点，并发现潜在的结合蛋 白基因，目前对于酵母单杂交技术的应用主要体现在这方面Chew et al (1999)应用酵母单杂交技术证实了在大鼠 脑中存在的COUP-TF I、EAR2和NURR1等蛋白质GRIK5基因的 内含子结合蛋白2.对DNA结合结构域进行分析如果能得到DNA结合结构域的结 构信息，就可以用酵母单杂交技术对该结构进行分析.Mak et al (1996)运用此技术测试哺乳动物具存基本 的螺旋-环-螺旋(bHLH)结构的转录因子，通过对肌调节因子 4(MRF4)的研究，证实其具有转录活性酵母单杂交方法(Y east One2hybrid method)是根据DNA结合蛋白(即 转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理来克 隆编码目的转录因子的基因(cDNA)该方法也是在细胞内(invivo)分 析鉴定转录因子与顺式作用元件结合的有效方法如图1所示，将己 知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子(minimal promoter , Pmin)上游，Pmin启动子下游连接报道基因进行cDNA融合表达文 库筛选时，编码H的转录因子的cDNA融合表达载体被转化进入酵 母细胞后，其编码产物(转录因子)与顺式作用元件结合，就可以激活Pmin启动子，并促使报道基因表达。
根据报道基因的表达，筛选出与 己知顺式元件结合的转录因子1、 限制哺乳动物神经元钠通道基因表达的一种沉默子蛋白REST［3 ］，与胡萝卜Dc3基因启动子ABA诱导和胚特异性表达 相关的顺式元件相互作用的一族新的bZIP转录因子［4 ］，都是应用 酵母单杂交方法获得1 cDNA AD融合表达文库的构建应用酵母单杂交方法筛选编 码特定转录因子的合适cDNA，首先要构建cDNA AD融合表达文 库AD是激活区的简写，一般常用G AL4因子对于某些正常情 况下不表达的基因，必须经过一些特定处理诱导其表达，才有可能克 隆到它们所编码的转录因子将分离提纯的mRNA合成cDNA，两端 接上带有合适酶切位点的连接物，构建到融合表达载体中G AL4 AD 下游的多克隆位点然后，进行噬菌体包装，在XL-1细胞内进行自 动剪接环化，最后提取cDNA质粒用于筛选2 酵母报道子的构建这是用酵母单杂交方法克隆特定转录因子 中的一个重要内容将已知的特定顺式元件的重复序列，按同一方向 串联连接起来，构建到接右报道基因的最基本启动子(Pmin)上游，再 将重组表达载体转化到酵母基因组中通过报道基因的作用，在选择 培养基上获得含右“-顺式元件-Pmin-报道基因的酵母转化子。
3 cDNA融合表达文库的筛选在构建文库时，cDNA是随机插 A AD融合表达载体，即编码目的蛋白的cDNA片段可能正方向或 反方向插入进去利用含有pHISi-1和pLacZi双重报道子的酵母转 化子来筛选cDNAAD融合表达文库4 阳性克隆的鉴定通常采用3AT抗性检测与半乳糖苷酶活性 检测两种方法來鉴定阳性兑隆取上述获得的阳性克隆菌落，充分悬 浮于 200 U1TE 溶液，涂布于含 60mmol/L 3AT SD/ His-，Ura-，Leu -选择性培养基上，真正的阳性克隆能在这样的条件下生长5 应用酵母单杂交方法分析阳性克隆在单杂交系统中通常使 用的是cDNA融合表达载体，即在酵母细胞内生成的蛋白质，是巾 G AL4因子的转录激活区即AD部分与插入的拟南芥cDNA基因共 同编码的融合蛋白阳性克隆中Pmin启动子的激活和报道基因的表 达，也存可能是AD部分与cDNA编码部分共同作用的结果因此需 要证实不依赖G AL4因子的AD融合部分，阳性克隆中cDNA编码 的蛋白质独立具备转录因子的作用此外，还要利用突变型顺式元件 來检测阳性克隆中cDNA编码的转录因子是否专一性与靶顺式元件 结合。
根据酵母单杂交原理，可在酵母细胞内进行这两方面内容的分 析6 酵母cDNA质粒的分离最方便的是采用酵母CD2NA分离系 统试剂盒得到cDNA质粒后，再转化到大肠杆菌进行扩增和其它操 作由于酵母单杂交方法检测特定转录因子与顺式作用元件专一性相 互作用的敏感性和可靠性，现己被广泛用于克隆细胞中含量微弱且 用生化手段难以纯化的特定转录因子酵母单杂交还被用来研究 RNA聚合酶II对转录起始的激活作用;单杂交技术与双杂交技术结 合，也被改进为反转双杂交/单杂交系统来检测蛋白质-蛋白质及 DNA-蛋白质间相互作用的解离;并且单杂交系统还能用来检测RNA2 蛋白质间的相互作用作为一项90年代中发展起来的新技术，酵母 单杂交系统在生物化学和分子生物学领域己经得到广泛应用。