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1、单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式1 1反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件第四章反相微胶团萃取与双水相萃取技术传统溶剂萃取技术的缺点： 1）一些被分离对象（如蛋白质）在40-50便不稳定，开始变性，而且绝大多数蛋白质都不溶于，若使蛋白质与有机溶剂接触，也会引起蛋白质变性。 2）萃取剂问题：蛋白质分子表面带有许多电荷，普通的离子缔合型萃取剂很难奏效。在水溶液中形成的胶体或微胶团，是由于表面活性剂中极性基团定向排列的结果。在这种由于在水溶液中加入表面活性剂而形成的胶体结构中，表面活性剂的极性基团（即亲水性部分）朝外，即靠向水溶液；而非极性基团（即疏
2、水性部分）则靠内而互相聚集成一种微胶团结构。 4.1 反相微胶团萃取技术的概念及分离原理反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件如果溶剂为非极性溶液，当加入表面活性剂至一定浓度时，由于表面活性剂的极性和非极性基团的定向排列，也会形成微胶团结构。但是这种微胶团结构与上述的微胶团结构相反，表面活性剂的非极性基团部分朝外，即朝向非极性溶剂部分；而极性基团部分则朝内，因而形成一种与水相微胶团结构反向的聚集体，这种聚集体就称为反相微胶团。反相微胶团萃取技术的概念及分离原理反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相
3、微胶团萃取与双水相萃取技术课件 在反相微胶团中表面活性剂的极性基团部分围成一个极性核心，称为水池。这个水池包括表面活性剂的极性基团内表面和其中的水分，以及溶解于水中的离子等。 具有亲水性的生物大分子就可以溶解于水池中的水分而被以微胶团的形式萃取出来。将待分离组分以微胶团形式进行萃取的过程，称之为微胶团萃取或胶团萃取；如果待分离组分是以反相微胶团的形式被萃取，就称之为反向微胶团萃取或反相微胶团萃取。反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件关于蛋白质及酶等生物大分子萃取机理的三种不同见解u 在反相胶团中，由表面活性剂的极性部分围成一个中心，中心为水等极性溶剂占有，生物大
4、分子就溶解于其中，并且在生物大分子周围包膜着一层水壳，对生物大分子起保护作用。此种见解即是所谓的水壳模型；u 生物大分子虽然溶解于由表面活性剂极性部分围成的中心部分,但在中心部分生物大分子是以被吸附的状态附着于胶团的极性壁上；u 生物大分子的非极性部分与多个微胶团的非极性部分连接，由此形成生物大分子溶解于多个微胶团之间的一种状态。上述几种见解中，以所谓的“水壳模型”解释具有较多的说服力。反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件表面活性剂 表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子，可分为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子型表面
5、活性剂。 常用的表面活性剂及相应的有机溶剂见下表。反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件在反相微胶团萃取蛋白质的研究中，用得最多的是阴离子表面活性剂AOT(AerosolOT，丁二酸-2-乙基己基磺酸钠)。这种表面活性剂容易获得，其特点是具有双链，极性基团较小、形成反微胶团时不需加助表面活性剂，并且所形成的反胶束较大，半径为170nm，有利于大分子蛋白质进入。反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件(1)CTAB(cetyl-methyl-ammoniumbromide)溴化十六烷基三甲胺/十六烷基三甲基胺溴(2)DDAB(didode
6、cyldimethylammoniumbromide)溴化十二烷基二甲铵常使用的阳离子表面活性剂反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件(3)TOMAC(triomethyl-ammoniumchloride)氯化三辛基甲铵将阳离子表面活性剂如CTAB溶于有机溶剂形成反胶束时，与AOT不同，还需加入一定量的助溶剂(助表面活性剂)。反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件bac微胶团与反相微胶团的形成反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件 微胶团：微胶团： 表面活性剂的极性头朝外，疏水的尾部朝内，中间形成非极性
7、的 “核”。水非极性的“核”极性“头”非极性“尾”反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件 反相微胶团：反相微胶团： 表面活性剂的极性头朝内，疏水的尾部向外，中间形成极性的“核”。有机溶剂极性“头”极性的“核”非极性“尾”反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件4.2 影响反相微胶团形成的因素 反向微胶团的形成、大小及形状，与表面活性剂的种类、浓度以及操作时的温度、压力等有关。反相微胶团一般比水相微胶团要小，其分子聚集数一般都小于50。而水相微胶团的分子聚集数在50100
8、之间。反相微胶团中的水分含量通常用非极性溶剂中的水浓度和表面活性剂浓度之比W0来表示: W0=H2O/表面活性剂 W0值越大，反相微胶团内的水分含量就越多，形成的反相微胶团的半径就越大。能溶解水溶性成分的量就越多。因此，W0大小可以反映出反相微胶团的大小和溶解能力。反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件4.2 影响反相微胶团形成的因素 表面活性剂要形成反相微胶团，在溶剂中的浓度必须达到一定值，否则就不能形成微胶团，这个形成微胶团所必需的最低浓度值，叫做表面活性剂形成微胶团的临界浓度(CMC)。 不同的表面活性剂的CMC值在0.1-1.0 mmol/L间，随温度、压
9、力和溶剂的变化而变化。最常用的表面活性剂为丁二酸二异辛酯磺酸钠(Aerosol OT，简称AOT)，分子式为： 1、表面活性剂和溶剂的种类反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件溶剂通常为异辛烷(2.2,4-三甲基戊烷)。AOT能溶解于有机溶液中，也能溶解于水中，并形成微胶团。AOT在形成反相微胶团时的W0较大，其值可达60。因此在微胶团内就可以溶解较多的生物大分子而提高了萃取效率。反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式
10、1919反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件微胶团内水相的酸碱度，主要影响到生物大分子的荷电性，进而影响到生物大分子与微胶团的结合。因为AOT属于阴离子型表面活性剂，其亲水部分带负电荷，形成的微胶团内表面带负电。p当微胶团内水相的pH值小于生物大分子的等电点（pI）时，可使生物大分子带正电，这样生物大分子可与微胶团中带负电性的内表面相吸而形成比较稳定的含生物大分子的微胶团，可以较易地进行萃取。p当微胶团内水相中的pH大于生物大分子的等电点时，生物大分子带负电，较难与微胶团内壳相结合而呈较低溶解甚至是不溶解状态，分离效率下降。2、水相的酸碱度通过调节水相中通过调节
11、水相中pHpH值值，达到分离溶液中不同组分的生物大分子。，达到分离溶液中不同组分的生物大分子。单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式2020反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件2、水相的酸碱度单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式2121反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件在低离子强度下，酶和蛋白质等生物大分子表面上的荷电性和亲水性得到了改善，溶解度上升，与微胶团内表面的结合力增强。当水相中的离子强度增加到一定的程度时，由于抵消了生物大分子表面上的电荷，并且由于离子的水化作用而使蛋白质分子表面上的水膜消失，
12、减少了与微胶团内表面的结合作用，从而降低了溶解度，使分离效率降低。3、水相中的离子强度单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式2222反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件3、水相中的离子强度单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式2323反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件4、W0值大小W0值的大小，也直接影响到反相微胶团的萃取效率。W0太小，说明微胶团内的水分含量不高，对生物大分子的溶解度下降，甚至当W0过小时，形成的微胶团太小，生物大分子就根本无法进入反相微胶团内，这就必然影响到萃取效率。下图表示了W0和蛋
13、白质溶解度之间的关系。单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式2424反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件4、W0值大小单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式2525反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件4.3 影响反相微胶团萃取效果的因素 水相的pH值决定了蛋白质表面电荷的状态、从而对萃取过程造成影响。只有当反相微胶团内表面电荷，也就是表面活性剂极性基团所带的电荷与蛋白质表面电荷相反时，两者产生静电引力，蛋白质才有可能进入反相微胶团。 对于阳离子表面活性剂、溶液的pH值需高于蛋白质的pI值，反胶束萃取才能进行
14、；对于阴离子表面活性剂，当pHpI时，萃取率几乎为零，当pHpI时，萃取率急剧提高。 1. 水相pH值对萃取的影响反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件2. 离子强度对萃取率的影响a. 离子强度增大后，反相微胶团内表面的双电层变薄，减弱了蛋白质与反相微胶团内表面之间的静电吸引，从而减少蛋白质的溶解度；b.反相微胶团内表面的双电层变薄后，也减弱了表面活性剂极性基团之间的斥力，使反相微胶团变小，从而使蛋白质不能进入其中；c. 离子强度增加时，增大了离子向反相微胶团内“水池”的迁移并取代其中蛋白质的倾向
15、，使蛋白质从反相微胶团内被盐析出来；d. 盐与蛋白质或表面活性剂的相互作用，可以改变溶解性能，盐的浓度越高，其影响就越大。反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件3. 蛋白质分子量对萃取率的影响 蛋白质的分子量对最大萃取率的影响见图。当蛋白质的分子量大于30,000时，最大萃取率小于50%，效果明显下降。因此如何使反相胶团变得足够大，使其能包住蛋白质，是反相胶团萃取中有待解决的一个重要课题。 反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件4. 阳离子种类对萃取率的影响 K+,N
16、a+,Ca2+这三种阳离子对溶菌酶萃取率的影响见图所示。在0.10.8mol/L浓度范围内，溶菌酶的萃取率几乎不随NaCl和CaCl2浓度变化而变化，一直保持在较高状态。阳离子种类对萃取率的影响主要体现在改变反相胶团内表面的电荷密度上。通常反相胶团中表面活性剂的极性部分不会是完全电离的,有很大一部分阳离子仍在胶团的内表面上。极性部位的电离程度愈大,反相胶团内表面的电荷密度愈大,产生的反相胶团也愈大。表面活性剂电离的程度与离子种类有关。反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件4. 阳离子种类对萃取率的影响反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件反相微胶团萃取与双水相萃取技术课件4. 阳离子种类对萃取率的影响表为同一离子强度下的四种离子对反相胶团中W0的影响。极性部位的电荷密度按K+、Ca2+、Na+、Mg2+顺序逐渐增大，电离程度也相应地逐渐增大。水相为MgCl2溶液时，水相混浊，不能很好地分相，这可能是因为极性部位的电荷密度太大，以致有些AOT溶于水相,形成乳状液。水相为NaCl或CaCl2溶时，萃取率基本上不随盐浓度变化而变化，这是因为Na+和Ca2+存在时,反
