基于高效液相色谱一质谱技术的早期胃癌血清代谢组学分析【】目的对比早期胃癌患者与健康人血清代谢产物的差异，寻找潜在的与早期胃癌相关的小分子代谢标志物方法应用高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)技术对16例早期胃癌患者与20例健康对照者的血清样本进行代谢组学检测采用主成分分析法(PCA)、偏最小二乘判别法(PLS-DA)和t检验统计分析早期胃癌实验组与健康对照组的差异代谢物，最后将找到的差异代谢物通过人类代谢组数据库(HMDB)检索鉴定结果与正常人相比，早期胃癌患者糖类、脂类等代谢可能存在异常，同时共筛选鉴定出9个对分类有显著贡献的代谢标志物结论基于HPLC-MS技术的血清代谢组学分析方法能够冇效区分早期胃癌与健康个体，对早期胃癌的诊断具有潜在的临床价值关键词】早期胃癌；代谢组学；代谢标志物[Abstract] Objective To compare the difference of the serummetabolites of patients with early gastric cancer and healthysubjects, so as to search for potential small molecular markersassociated with early gastric cancer.Methods Scrum samples from 16 patients with early gastric cancer and 20 healthy controls were examined by high performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-.V1S) . Principal componentanalysis ( PCA ) ， partial least squares-discriminant analysis(PLS-DA ) and t test were used to statistically analyze thedifferential metabolites of early gastric cancer experimental groupand healthy control group. And the differential metabolites wereidentified by searching human metabolic database (HMDB).Results Compared with normal people ， the metabolism ofcarbohydrate and lipid might be abnormal in early gastric cancerpatients. At the same time , 9 metabolic markers which havesignificant contribution to classification were screened out.Conclusion Scrum mctabonomics analysis method based on HPLC-MStechnology can distinguish early gastric cancer from heal thyindividuals, and has potential clinical value in the diagnosis ofearly gastric cancer.【Key words] early gastric cancer； metabolomics； biomarkers胃癌作为我国常见的一种高发肿瘤，每年新增病例及死亡病例都居世界前列。
其早期症状隐匿，很多患者在就?\时已属晚期，失去了手术治疗的最好时机而其预后又与治疗的时机密切相关，因此胃癌的早发现非常关键胃癌是一种多基因参与，多步骤遗传学改变的消化系统疾病，其基因在转录、翻译和翻译后的修饰等各个环节都可能发生变异，因此用单个或数个生物标志物进行检测解决不了低敏感性和低特异性的问题1999 年，Nicholson等［1］提出了 “代谢组学” (metabonomics)的概念，将其定义为“对新陈代谢过程中所有低分子量（＜1000 D）代谢产物进行定性和定量的研宂，以反映生物体对外界刺激或基因修饰所发生的变化的科学”，它研究的主要对象是生命新陈代谢活动的终末产物［2］正常状态下,体内各代谢产物处于动态平衡，在机体出现代谢障碍或者受到其他因素如肿瘤等疾病影响时，代谢产物的成分和浓度也会发生相应变化［3］所以通过代谢组学技术对生物体内随时间变化的代谢产物进行定量和定性分析，便能将代谢产物的变化与病理生理过程中的生物学事件直接联系起来本实验通过高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）技术对早期胃癌血清中小分子代谢产物进行研究，探讨代谢组学方法在早期胃癌诊断中的作用1对象与方法1.1研宄对象冑镜和病理检查证实的16例早期胃癌实验组，20例健康对照组。
实验组平均年龄（638）岁，男性12例，女性4例对照组平均年龄（615）岁，男性8例，女性12例由于代谢产物受多因素的调节，为避免干扰，胃癌患者入选前未经任何抗肿瘤治疗排除标准：（1）本身具有代谢性疾病，如糖尿病、痛风、高脂血症等；（2）血液疾病；（3）怀孕或哺乳期女性；（4）过去2周曾发生重大的应激反应，如烧伤或者精神创伤等;（5）过去两周服用特殊药物如抗生素、激素、非逛体类抗炎药；过去2周有任何急性疾病症状；（6）采血前采取过任何医疗措施早期胃癌根据2010年国际抗癌联盟/美国癌症联合委员会（UICC/AJCOTNM分期标准（第7版）实验组均为TNM IA期实验组胃镜诊断标准：早期胃癌无论有无淋巴结转移，早期病变局限于黏膜及黏膜下层，常见于胃窦部、胃体部及 小弯侧按具体形态分型可分I型隆起型（息肉型）、II型浅表型（胃炎型）和m型凹陷型（溃疡型）三型I型主要表现为黏膜局部突起，突向胃腔，一般表面较粗糙带蒂，有的呈乳头状或结节状，表妞常伴有糜烂n型浅表型边界常不整齐，边界不清，局部黏膜稍显粗糙，略隆起或凹陷，表面颜色常变淡或发红，可伴糜烂m型常见有较明显的溃疡，多超过黏膜层实验组病理诊断标准为旱期胃癌：癌组织局限于黏膜及黏膜下层。
1.2仪器与试剂高效液相色谱-质谱仪：Agilent 1200 （G6410A）,美国Agilent公司; 超纯水系统:Milli-Q，美国Millipor公司;自动液体进样器：美国Agilent公司Agilen;甲醇、乙腈、甲酸、异闪醇，美国Sigma公司1.3样本采集采集入选人员空腹血标木3 ml于含有肝素钠的采血管巾静止1 h凝固分层，离心（3000 rpm 10 min），取上清液分装至离心管，保存于_80C冰箱待用1.4样本预处理将低温保存的血淸样本放置室温解冻混匀，取100 PL血淸放入离心管，加入300 uL乙腈摇晃混匀15 s，室温静置15min，后在4C，10 000rpm离心lOmin，取上清液200 pL，在常温下干燥60〜90 min,再取上清液用50 PL乙腈/水溶剂（3:1）复溶，取上清液过0.22 Pm水相膜，然后上清液加入100 UL内标（L-2-氯苯丙氨酸有独立的色谱峰，不会干扰正常样本检测，常被用来作为内标）后与超纯水室温放置1 h后上样分析1.5 质控(quality control, QC)为了观察试验方法的稳定性，在每6个血清后分别都加入一个QC样本。
QC样本制备：室温摇匀解冻的血、尿样本取5 uL,加入甲醇和乙腈1 : 1混合液再加入L-2-氯苯丙氨酸作为内标其余处理同上文1.6 HPLC-MS分析条件色谱条件：色谱柱选用Zorbax SB-C18柱(4.6 mmX 100 mm, 3. 5 Pm)柱温维持在45C，流动相为：A为含水甲酸，B为乙腈、甲醇、异丙醇、甲酸混合溶液单次进样5 PL，流液速度：l.Oml/min质谱条件:采用ESI，正离子模式下：毛细管电压4 KV，电子能量3eV，延时溶液5min,离子源温度115C，干燥气温度350C,干燥气流速9 L/min,参比荷质比(m/z) 80〜900,质量全扫描范围100〜1000，扫描时间0.03 s1.7数据处理与统计分析(1)将液相色谱质谱仪获得的原始数掘通过Analyst 1. 5. 1软件(ABSciex公司)采集，得到两组样本的总离子流图(TIC)o同时通过软件获得保留时间和精确质核比组成的样本名称、谱峰索引和峰强度面积然后将原始数据使用AB Sciex公司提供的MarkcrVicw软件进行归一化得到相对浓度，其次继续标度化、滤噪和峰对齐等处理，得出的数据再进一步行统计学分析。
2)通过MarkerView软件采用主成分分析(PCA)方法对原始数据进行初步分类，同时绘制样本分布得分图(Score plot)得分图上一个样品代表一个点，每一个点的位置仅与该样本的小分子代谢产物的成分及浓度大小有关，一般相似病理生理的样本组成成分类似，所以在得 分图上会相对靠近，一定程度上会有集中的趋势样木之间的离散程度越 大，距离越远，说明样本间状态差异越大我们选取的样本来自于两个不 同病理生理状态的群体，猜测同一来源样本在得分图上会相对靠近，反之相对远离通过此来观察两组的离散和聚集情况然后应用有监督模式识别方法偏最小二乘判别法(PLS-DA)制图，进一步分析得到能区分组间差异的代谢物即找出联合变量重耍性因子值(variable importance in theprojection, VIP)大于1的代谢产物，再对这些产物进行t检验，找到有差异的代谢物(P〈0.05)最后将找到的差异代谢物通过人类代谢组数据库(HMDB)检索鉴定2结果2. 1 HPLC-MS检测结果实验组和对照组的血淸样本通过检测和Analyst采集获得总离子流图(TTC)通过整体的总离子流图可以直接观察出两组样木代谢产物的差异，箭头所示在同一保留时间样本之间峰度值的差异。
见图12.2 PCA与t检验无监督模式PCA是将多个有联系的变量变为少数几个综合变量，建立尽可能少的独立新变量来反映原数据的大量信息，从而达到降维的目的[4] 从PCA的得分图(图2-A)可知实验组和对照组个别存在交叉，但总体分离趋势明敁模型解释了 73% (R2X 0.73)的原始数据，然后应用有监督方法PLS-DA对数据进一步分析，图中(图2-B)结果相对PCA分类明显改善，两组间完全分离，98. 2%的样本符合模型判别(R2Y 0.982),并且模型预测能力达到91.4% (Q2Y 0.914),表明本模型稳定性及预测性均较可2.3旱期胃癌??在标志物鉴定结合PLS-DA中的VIP值与t检验结果筛选出组间差异代谢物，通过人类代谢组数据库（HMDB）检索鉴定，得到9种在两组间中存差异的代谢物，其相对浓度差异均有统计学意义（P〈0.05）3讨论目前发现的胃癌血淸肿瘤标志物主要包括PG、TK、FAS、CA724、CEA、CA199、MG7-Ag、幽门螺杆菌抗体、肿瘤自身抗体、胃癌相关血清蛋白、激素类、细胞因子[5。