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1、大肠杆菌变种EspA的研究进展【关键词】 大肠杆菌0157： H7；基因，EspA大肠杆菌是最常见的微生物之一，在自然界广泛分布，在动物体内也存在。 它具有易培养、生长快、易变异等特点。肠出血性大肠杆ffi(enterohemorrhagic Ecoli, EHEC)是大肠杆菌的一个变种，曾在多个国家暴发流行。感染主要导致 腹泻、出血性结肠炎(hemorrhagic colitis, HC),并经常伴发溶血性尿毒综合 征(hemolytic uremic syndrome , HUS) 血栓形成的血小板减少性紫瘢 (thrombotic thrombocytopenic purpura , T
2、TP)并发症，严重威胁着人类 的生命健康1。人类感染此菌的途径主要是食用或接触污染的牛肉、蔬菜、水 果及水源等。1982年，美国首次从岀血性腹泻患者的粪便标本中分离到该菌， 并报道与食用汉堡牛肉饼有关。这是人类第一次认识到大肠杆菌0157 : H7可 作为一种病原菌使人类致病，但此吋并没有引起医学界的足够重视。此后，大肠 杆菌0157 :H7引起的感染在美国、加拿大、英国和H本等发达国家迅速增加, 逐渐引起广泛重视。我国于1987年由权太叔等首次从出血性结肠炎患者粪便中 分离到0157 :H7大肠杆菌。此后，福建、浙江、广东、河北、宁夏等十儿个省 陆续分离出该菌。FI前美国、英国、加拿大等国家
3、又出现了新的耐药性变种2, 3,导致了多人死亡。因此大肠杆菌致病变种引起了国内外学者的密切关注，并 对大肠杆菌变种进行了深入的研究。现仅以EHEC血清型0157： H7为例，对 它致病因子III型分泌蛋白即EspA( Esp为E coli secreted protein缩写)进 行综述，为对该菌引起的疾病进行预防、诊断和治疗提供有力的依据和参考。1 EspA的研究意义H前，对0157 :H7感染尚缺乏有效的防治方法，只能给予对症治疗和适当 的抗菌治疗，但研究证明抗菌纱物可促使0157 : H7大肠杆菌释放Vero毒素， 从而使患者并发HUS的危险性增加。发病机理主要通过细菌对上皮细胞粘附和
4、产生毒素两个过程。粘附是细菌感染的第一步。当EHEC侵入机体肠腔后，借 助菌毛局限性地粘附在盲肠和结肠上皮细胞的刷状缘上并损害微绒毛，同时紧密 地结合在肠上皮细胞膜的顶端。III型fepA在细菌的粘附定植中起到关键作用。 EspA形成纤丝样管状结构，在细菌和宿主细胞之间架起一座桥梁，把效应蛋白 转移至宿主细胞表面，对细菌粘附至宿主内皮细胞具有关键性启动作用，并且 EspA具有良好的免疫原性及免疫反应性，可以作为候选免疫原，用于0157的 疫苗研制,在消除定植带来的A/E(attaching/ effacing)损伤,缩短感染周期 具有较大的应用价值。2 EspA的基因与分子结构编码EspA的基
5、因主要存在于染色体上大小为35kb的被称LEE(locus of enterocyte effacement)的毒力岛上4, LEE包括40多个开放阅读框 (0RFs),至少5个操纵子，编码EspA的主要是LEE4EspA共578bp,表达的 蛋白约为 25KdaoEHBD 的III型分泌系统(type III secretion system,TfS)是 特异的，但与细胞壁相连的针状复合体却是保守的。此复合体是由EspA构成的 纤丝伸展成的针状物5,6。它的三维结构由5根EspA纤丝螺旋向前延伸，形 成外径为12nm 内径为的四周密闭的中空螺旋管，外表面布满了螺距 为4.3nm的线性螺旋构成
6、的脊和槽，脊弯曲成扇形样，是EspA亚单位的特征。 与外面相比较，的通道是平滑的6。EspA纤丝样针状物的长度可由细菌 内EspA亚单位的数量调节7。有直接证据证明EpB、EspD效应蛋白是从 此管道内被转入到宿主细胞膜上，并形成35nm的小孔，而其它效应蛋白(lir, EspF, Map, Esp G,EspH, Cif,和Esp l/NleA)沿通道及小孔更容易进入宿主 细胞711。3 EspA表达的调节EspA的表达是转录后调控的，需要有合适的环境条件先引起LEE124表 达，接着受到EspA、EspB、EspDmRNA转录翻译的进一步调控。从牛体内分 离出两株野生型0157 :H7 ,
7、 一株为EspD高表达，一株为低表达，先在M9 培养基中培养，然后转入MBVI-HEPES中培养，EspD高表达株细菌的EspA表 达阳性率为70%95%,血低表达仅为30%o Esp表达具有培养基依赖性，在 M9基本培养基中不能表达，而MBVI2HEPES改良培养基则能促进纤丝样EspA 的表达及效应蛋白的分泌。碳酸氢根离子加入到Luria肉汤中可以刺激效应蛋白 的分泌12o toxB基因与IbxB大质粒上的toxB基因编码一 362kD的蛋白 loxB,对IbxB的氨基酸序列与许多粘附因子有同源性，能促进III型分泌系统分 泌粘附因子。将EHEC 0157 Sakai菌株中的pO157去除
8、血构建 O157Cu(O157 cured of pO157)后发现：缺失 pO157 的 0157 Sakai 对 宿主细胞的粘附能力下降；将携带toxB基因的mini2pO157 (plC137)导入 O157CU后可增强其粘附力；携带plC137的0157CU可刺激EspA、EspB 和Tr的产生及分泌。H前认为IbxB影响III型分泌系统分泌蛋白质是在转录后水 平上发生的13o EspA的表达具有时效性。在整个对数生长期表达在较高水 平，而到了静止期后则迅速下降。另外，一旦fepA完成效应蛋白EspB , D及 Tr的转运，为了 intimin与受体朮更好地结合以便细菌更紧密地粘附到宿
9、主细 胞，EspA会从细菌表面上脱落，表达也会降低14。4 EspA在粘附损伤中的作用EspA以多聚体形式存在，形成纤维样管状结构，连接到宿主细胞表面， EspB. EspD经过此通道分泌到宿主细胞，并在细胞膜表面形成小孔。Fvaz和 Vander15发现此EspA、EpB、EpD蛋白组成了一个分子注射器(molecular syringe)的结构，EspB 和 EspD 就像注射器的尖部(tip of molecular syringe), 可以在宿主细胞膜上形成孔道，然后将W注入到宿主细胞膜上。intimin与Tr 结合后可引起宿主细胞信号转导反应并导致细胞骨架重排而形成特异性损害5, 1
10、6, 17。实验证明EspA介导细菌对宿主细胞的粘附。将EspA突变株灌入SPF 级ICR封闭群小鼠体内，检测粪便排菌情况，4 H后灌入突变株组无一只小鼠 检测出细菌，血野生株则28天还能检测到6只小鼠中的5只有细菌排出，通 过电镜和免疫荧光技术观察粘附改变，发现EpA突变株粘附明显减少。体外细 胞粘附实验也证明对Hela细胞的粘附被减弱18o Robert K. Shaw和Sarah Daniell等17利用扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(7BVI)观察到EspA在红细胞粘附中的作用。EspA缺失突变株与红细胞(RBC)混合培养，发 现RBC不被破坏，而野生株则出现严重溶血，证实了
11、 EspA在溶血中起到重要 作用。5 0157 EspA的免疫学性质5.1 EspA交义反应性III型EspA广泛存在于致病性G杆菌中，在非致病菌肠杆菌中未见表达。 对0157 :H7的分子进化研究发现EPEC和EHEC的L EE高度同源4。 Biance C. Neves等19研究了 EPEC十种不同血清型的EspA分子特征和 超微结构，在全部血清型中，fepA多肽序列至少有65%的一致性。其中对 O127:H6和O55:H6两种血清型比较分析发现，两者的EspA多肽序列完全一 致；而 0111:H2 和 O128:H2 也至少有 95%的一致性。Marita Noguerabenza 等2
12、0调查了北美的墨四哥市和弗吉尼亚州诺福克市123名妇女乳液，发现 有90%以上存在BpA抗体。因为BpA比其它毒力分子更加保守，来源不同 的多型病原体的EspA变杲体具有结构相似性，抗EspA抗体有高发生率及广泛 的交叉反应，因此EspA抗体提供了对多种血清型广泛交叉的保证作用。通过序 列分析显示O127:H6和O157:H7的EspA具有85%tH同，EspA抗体能够阻止 EPEC和EHEC许多血清型的粘附，不像抗LPS或intimin抗体仅对有限的肠道 病原体有保护作用。并且EspA是表面表达和多聚体形式存在，具有良好的免疫 原性，抗EpA抗体常比其它表面蛋白的抗体存在的数量为多；BpA的
13、天然暴 露可诱导良好的免疫反应且持续时间长，这些因素使它可能成为研制抗EHEC 和EPEC多利血清型疫苗的有力的候选者。以此设计的疫苗相对于0157 LPS能 够提供广泛的交叉保护作用21 。但也有报道，EPEC E2348/69和EHEC 85-170 的EpA抗体不具有交叉反应性，尽管它们Z间基因同源性较MoEHECO157:H7 的fepA可以显著减少家畜的感染，但不能保护其它血清型的感染。如EHEC O26:H11, EHEC O103:H2和EH国0111 5。因此研制融合重组的EspA疫 苗是非常必要的。5.2 EspA免疫原性及免疫保护性EPEC和EHEC的EspA对人和动物都有
14、免疫原性22O用EspA重组蛋 白成功诱导兔的免疫应答，噬菌体呈现技术显示有相应抗体产生。用传统的噬菌 体抗体洗脱和菌落过滤器筛选的方法筛选出抗体库，得到EspA特异性抗体。识 别E coli 0157的fepA抗体也能识别来源于eae基因突变缺失的 O157DM3株和0111株的fepA分泌蛋白22。用EspA重纽蛋白加VS2 低剂皮下接种已感染0157 :H7的牛体内，发现抗EspA抗体滴度比对照组增 加13倍，细菌的粪便排泄显示减少23O D. Karpman等24用免疫印迹 的方法研究了 fepA重组蛋白的血清免疫应答反应，并检测了感染0157:H7后 的病人血清中EpA、EpB的抗体
15、，包括三者的IgG,及EspA和EpB的IgA、 IgM,结果显示具有较高的特杲性和敏感ttoYuling li和曰zabeth Frey等25 观察了人对O157:H7的EspA的免疫应答，方法是用免疫印迹及EUS技术检 测感染过O157:H7人血清对纯化的EspA重组蛋白的免疫反应，结果显示感染8天后的病人血清对EspA有强烈反应，说明人感染O157:H7后产生了 EspA抗 体，揭示EspA可作为研制预防EH西感染疫苗的候选抗原分子。6结语EHEC O157:H7感染尚缺乏有效的治疗手段，研制预防EHEC O157:H7感 染的疫苗成为可行血有效的办法。细菌粘附是感染的第一步，如果能阻止
16、细菌的 粘附，不仅可以阻止细菌的感染，还能有效地预防0157感染开始时粘附所造成 的A/E损伤。EspA是0157引起的A/E损伤的关键分子，具有良好的免疫性 和交叉保护性，是研制0157疫苗的重要候选抗原。根据BpA结构及表达的 特点，在进行0157研究与疫苗研制过程中需注意以下两点：EpA分泌表 达的吋效性。因为EspA具有菌株依赖性和生长周期的依赖性，并且在完成效应 蛋白的转移后即脱落或消失，所以要控制好条件以保证细菌EspA的分泌表达。 如何保证天然的构象。EspA是一个多聚体，结构较为复杂，天然构象的改变 可能影响其活性及免疫特性。【参考文献】1 Li Y, Frey E Mackenzie AM, et al. Human response to Escherichia coli O157:H7 infection : antibodies to secr
