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1、实时荧光定量PCR检测大肠癌腹腔微转移及其临床意义作者：钱俊郑树中西速夫光幸秀平井孝加藤知行【摘要】目的应用实时荧光定量PCR技术检测大肠癌腹腔内游离癌细胞并探 讨其临床意义。方法2003年5月至2004年1月，收集在日本爱知癌症中心 手术81例大肠癌病例的腹腔冲洗液，每个样本的cDNA均应用两种引物合成(随 机引物和寡核甘酸引物)，并在罗氏实时荧光定量PCR (LightCycler)上进行定 量分析。每个样本同时进行常规细胞学检查。所有病例术后经过平均为1年的随 访。结果CEA mRNA和CK-20mRNA的阳性率和阳性值均与肿瘤的浸润深度(T )、 分期以及淋巴结转移相关。在一个合理界定
2、值上，CEA和CK-20检测的敏感度与 特异度均为100%，而常规的细胞学检查则为33%和100%。结论CEA和CK-20 mRNA定量分析是检测大肠癌腹腔微转移的敏感和特异的方法，CEA和CK-20mRNA 水平的异常与术后的无瘤生存率显著相关。【关键词】大肠肿瘤癌胚抗原细胞角蛋白20实时荧光定量RT-PCRQuant i tat i ve Detection of Disseminated Cancer Cells in Peri tonea 1 Washes with Real-Time RT-PCR for Patients with Colorecta1 Carcinoma and
3、Its Clinical SignificanceAbstract: Purpose To detect the free cancer cells in peritoneal cavity in patients wi th colorecta I cancer by quant i tat i ve real-time RT-PCR method and investigate its clinical significance. Methods From May 2003 to Jan. 2004, peritoneal wash was obtained from 81 cases w
4、ith colorectal cancer in Aichi cancer center. cDNA was synthesized from mRNA extracted from peritoneal washes by 2 kinds of primers (random primer and oligo primer). Quantification of CEA and CK-20 mRNA was performed on a LightCycler instrument with hybridization probe. A part of each peritoneal was
5、h was also examined by convent ional cytology. Al 1 patients were fol lowed up wi th an average period of 12 months. Results Both CEA mRNA and CK-20 mRNA positive rates and values were significantly correlated with depth of tumor invasion, staging, 1ymph node metastasis. SensiIivily and specificity
6、of CEA and CK-20 real-time RT-PCR with an appropriate cutoff value were al 1 100%, whereas those of conventional cytology were 33%, and 100%, respectively. Conclusion Both CEA and CK-20 mRNA quantifications are sensitive and specific methods for detecting micrometastasis in the peri toneaI washes wi
7、 th colorectal cancer. AbnormaI i ty of CEA and CK-20 mRNA in peritoneal washes is correlated with disease free surviva1 for colorectal cancer.Key words: colorecta1 neoplasms; carcinoembryonic anti gen;cytokeratin-20; real-time RT-PCR大肠癌为常见多发的消化道恶性肿瘤，随着生活水平的提高和饮食习惯的改变, 大肠癌的人群患病率有所上升，并有年轻化趋势。目前，大肠癌病人
8、尽管接受了 以手术为主的根治术，但临床上仍有50%的大肠癌患者死于术后的肿瘤局部复发 和转移，成为手术治疗失败的主要原因1, 2。因此，应用先进的分子生物学技术、 建立定量荧光RT-PCR方法检测大肠癌肿瘤标志物、术后转移的早期诊断受到高度 重视。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA )是大肠癌细胞去分化过程中 表达的一个重要标志，是最有价值的肿瘤标志物之一。细胞角蛋白20 (cylokeratin-20, CK-20)是上皮细胞骨架的组成成分，表达于正常上皮及上皮 源性原发肿瘤及其转移肿瘤细胞。CK-20表达范围严格，它仅局限在胃肠上皮细 胞，且在侵袭、转移、
9、扩散到其他组织器官时，始终保持稳定。胃肠道检测细胞 角蛋白20 (CK-20 ) mRNA (CK-20 mRNA )可作为大肠癌患者血及骨髓转移的重要 标志物。本研究应用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术，三磷 酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA为内参因子3,检测大肠癌病人手术腹腔冲洗液中 游离细胞的CEA mRNA和CK-20 mRNA,结合术后对病人随访，研究结果将为正确 诊断肿瘤浸润程度和复发可能性，对大肠癌术后转移的早期诊断有重要意义，同 时为肿瘤病人术后放疗、化疗方案的确定提供参考依据。1材料与方法1. 1细胞株人结肠癌肝转移表达CEA中分化腺癌细胞株，由日本爱
10、知癌症中心癌症研究所肿 瘤病理实验室建立,并培养于加入10%小牛血清(GIBCO BRL, Gaithersburg), 100U/ml 青霉素和 100 m g/ml 链霉素的 DMEM 培养基(Nissui Pharmaceutical, Tokyo, Japan)中。1. 2病例收集收集从2003年5月至2004年6月在爱知癌症中心手术的81例大肠癌病例，其 中包括39例结肠癌，40例直肠癌，以及2例结直肠双发癌。病例分期根据2001 版UICC分期：2例0期，3例I期，34例II期，31例III期，11例IV期。1. 3腹腔冲洗液收集和保存手术开始进腹后，立刻分别用100ml生理盐水冲
11、洗盆底和膈下，轻微搅拌后回收 冲洗液。离心(1 800r/min, 5min), PBS重新冲洗游离细胞沉淀，溶解于Isogen 溶液中(Nippon Gene, Tokyo, Japan), -80C保存至使用。其中一部分冲洗液同 时做常规Papnicolaou染色，以进行细胞学检查。1. 4 RT-PCR 检测应用随机引物和寡核甘酸引物检测腹腔冲洗液游离细胞CEA mRNA, CK-20 mRNA 和GAPDH mRNA,经细胞总RNA提取cDNA合成实时荧光定量RT-PCR步骤。 寡核昔酸引物为：CEA 引物： 5 z -AACTTCTCCTGGTCTCTCAGCT , 5 7 -GCA
12、AATGCTTTAAGGAAGAAG;荧光 探针：5, -TGAAATGAAGAAACTACACCAGG, 5, -CTGCTATATCAGAGCAA-CCCCAA ;CK-20 引物：5 7 -CAGACACACGGTGAACTATGG ,5 -GATCAGCTTCCACTGTTAGACG;荧光 探针：5 -AGACGGTCATTTAGGTTCTGCAT, 5 -GCCATTTTCTCATTGCCAACA ; GAPDH 引物：5 -TGAACGGGAAGCTCACTGG , 5 -TCCACCACCCTGT-TGCTGTA;荧光探针：5Z -TCAACAGCGACACCCACTCCT, 5
13、7 -CACCTTTGACGCTGGGGCT。PCR的扩增使用Roche的LightCycler扩增仪，总反应体积为10p 1包括:TaqDNA 聚合酶，dNTP 混合物和缓冲(LightCycler DNA Master hybridization probes, Roche), 4. OmM MgC12, 0.25 口 M 引物 D 和 E, 0. 4 口M 的探针,Ipl 的模板 cDNA, 于 Roche 的毛细管中。95C (10s)变性,50oC-55C (10s)淬火，72C (10s)延伸, 共50次循环，每次试验包括6个外对照管，1个阴性对照管，和未知浓度病人样 品管。mRN
14、A的定量可在LightCycler上与标准曲线对照后由软件自动计算得出。1.5统计分析根据肿瘤浸润深度(T)、肿瘤分期、淋巴结转移，应用卡方检验进行组间CEA mRNA 值以及CK-20 mRNA值差异性分析。无瘤生存率用Kaplan-Meier方法计算。1.6术后随访所有病例均入全日本大肠癌病例库并按照爱知癌症中心术后随访程序随访，无失 访。随访截至日期到2005年12月31日。2结果2. 1常规细胞学检查所有81例病例均做常规病理学检查，只有1例(1.2%)诊断为阳性。Papnicolou 染色5级。其他71例1级，8例2级，1例3级。2. 2大肠癌腹腔冲洗液中CEA水平2. 2. 1利用
15、随机引物合成CEA cDNA由于每个样本，都是用两种不同的引物(随机引物和寡核昔酸引物)来合成cDNA, 故可以得到两个不同的实时荧光定量PCR的结果。CEA mRNA (利用随机引物合成) 在4个黏膜层和黏膜下层的早期癌中均未能检出。根据以往在爱知癌症研究所的 研究结果，将界定值定在1.0。大于1.0定为阳性，小于1.0定为阴性。从盆底 和膈下收集的标本只要有一处CEA mRNA值为阳性，该病例定为阳性。应用实时荧光定量PCR,共检测了 81例腹腔冲洗液标本，在pTis-h pT2. pT3 和pT4各组病例中，阳性率分别为0、0、10.9%、30%(P<0. 05),各组病例的 平均
16、值分别为：0、0、31.2、12.8, T4病例较低的CEA mRNA值也反映了细胞学 检查的结果(0)。CEA mRNA平均值在淋巴结转移阴性，淋巴结转移阳性病例中阳 性率分别为 5% (2/40), 17.1% (7/41) (P<0. 05), CEA mRNA 平均值为 8. 03, 31.05(P<0. 01)o CEA mRNA在I、II、IIL IV期各组病例中,阳性率分别为0、 3%、9.6%、44.44%(P<0. 05),各组病例的平均值分别为:0、1.16、10.33、 112. 33 (P&U; 0.01)。腹腔转移阳性病例的CEA mRNA平均值( 451. 95 )显著高于 腹腔转移阴性病例(6.32) (P< 0.01)o2.2.2利用寡核昔酸引物合成CEA cDNA在 pTis-l.pT2.pT3 和
