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1、基质金属蛋白酶抑制基因RECK在早孕自然流产绒毛组织中的表达及意义作者：方媛媛，刘福民，朱学文,李晓博单位：徐州医学院附属医院妇产科，江苏徐州221002;2.徐州医 学院附属医院中心实验室【摘要】目的 观察早期自然流产患者绒毛组织中RECK基因 基质金属蛋白酶(MMP)抑制基因)的表达及其与MMP-2、-9之 间的关系。方法采用半定量RT-PCR和Western blotting法检 测20例早期自然流产患者和20例正常早期妊娠绒毛组织中 RECK、MMP-2和MMP-9基因的表达情况。结果 早期自然流产 患者绒毛组织中MMP-2及MMP-9的mRNA表达水平低于正常早期 妊娠者，差异有统计
2、学意义(P< ;0. 05) ;RECK mRNA的表达高于 正常早期妊娠者，差异有统计学意义(P<0. 05)。自然流产 患者绒毛组织中MMP-2、MMP-9蛋白表达低于正常早期妊娠者， 差异有统计学意义(P<0. 05) ;RECK蛋白表达高于正常早期妊 娠者，差异有统计学意义(P<O. 05) oRECK蛋白与MMP-2、 MMP-9蛋白之间存在明显的负相关。结论RECK表达的增加进而 抑制MMP-2. MMP-9的活化，致使滋养细胞侵袭能力下降，可能 与孕早期自然流产的发生有关。【关键词】自然流产，早期；绒毛；RECK;基质金属蛋白酶 Expression of
3、matrix metalloproteinase suppressor gene RECK in villi of early spontaneous abortion and its significanceFANG Yuanyuan 1, LIU Fuminl, ZHU Xuewen2, LI Xiaobo3, WAN Meirong2, LIU Xiaoyun2, FENG Xia2 (1. Department of Obstetrics & Genecology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou,Ji
4、angsu 221002, China; 2. Department of Central Laboratory, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College; 3. Department of Clinical Medicine, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221004)Abstract： Objective To investigate the expression of matrix me tai1opro t e i nas e suppressor gene RECK and its
5、 relationship with matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and MMP2 in villi in patients with early spontaneous abortion (ESA). Methods The expression of RECK, mRNA and protein of matrix metalloproteinases MMP-9 and MMP-2 in villi of ESA patients (abortion group, 0=20) and normal first trimester pregnant
6、 women (control group, n=20) was detected by semiquantitative RT-PCR, Western blotting, respectively. The correlations between the expression of RECK and the expression of MMP-2, MMP-9 were analyzed by Pearson test. Results The expression of MMP-9 and MMP-2 inRNA was significantly lower in villi of
7、the abortion group compared with that of the control group (P< ;0. 05). The expression of RECK mRNA increased significantly in villi of the abortion group (P<0. 05); Western blotting analysis demonstrated that the expression of MMP-9 and MMP-2 protein in villi of the abortion group was signific
8、antly lower than that of the control group (P<0. 05). The expression ofRECK protein in villi was significantly higher in the abortion group than in the normal control group (P< 0. 05); (3)The expression of RECK protein in villi of first trimester had significant negative-correlation with that
9、of MMP-2 and MMP-9. Conclusion The increase in the expression level of RECK inhibited the activation of MMP-9 and MMP-2, and resulted in a decrease in the trophoblastic invasion of human placenta, which might be correlated with occurrence of first trimester spontaneous abortion.Key words： spontaneou
10、s abortion, first trimester; villi ;RECK; matrix metalloproteinases妊娠是成功的半同种异体移植现象，滋养层细胞对子宫蜕膜的 侵入以及对子宫螺旋小动脉的“血管重铸”是孕 卵着床后胎盘建成的关键步骤。研究表明，多种因素造成自然流 产时伴有滋养细胞某些生物学行为的改变，尤其是滋养细胞侵袭 力不足，螺旋小动脉不能转化为低阻力血管,胎盘局部缺血缺氧, 这可能与早期自然流产(early spontaneous abortion, ESA)发 生有关。Guo等1前期研究结果表明基质金属蛋白酶(matrix metall
11、oproteinase , MMP) 抑 制 基 因 RECK(reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs)及MMP-2在正常早孕滋养细胞的侵袭中起着重要作用， 然而RECK在人类早期自然流产中的研究网上检索未见报道。本 实验采用半定量RT-PCR和Western blotting方法研究自然流产 患者绒毛组织中RECK、MMP-2和MMP-9等基因的表达情况，探讨 其与自然流产发生的关系。1材料和方法1. 1研究对象 选择2009年1月至2009年6月在徐州市妇 幼保健院妇科门诊就诊的自然流产患者20例为流产组，停经时
12、 间在12周以内，患者平均年龄(30. 3±4.4)岁，平均孕周 为(9. 3±2. 9)周。选择同期正常早孕自愿要求终止妊娠者 共20例为对照组,平均年龄(29. 6±4. 3)岁，平均孕周为 (7. 9 ±2. 5)周，术前B超证实胎儿发育正常，既往无不 良妊娠史。2组平均年龄及流产时平均孕周无显著差异;均排除 严重的内科疾病以及传染性疾病和生殖道感染，亦未发现生殖道 畸形。1. 2方法1. 2. 1标本采集在无菌操作下采集离体绒毛组织，用PBS 液冲洗后立即置于液氮中速冻后-80C保存待用。1. 2. 2 RT-PCR检测mRNA用
13、Trizol-离心柱法提取总RNA, 用RT-PCR方法检测上述标本中RECK、MMP-2和MMP-9的mRNA表 达水平。引物按照参考文献2由上海英骏生物有限公司合成。RECK 引物： 上游引物为 5′ -TGC-AAG-CAG-GCA-TCT-TCA-AA-3&pr ime下游引物 为 5′-ACC-GAG-CCC-ATT-TCA-TTT-CTG-3′, 设 β-actin作为内参照。PCR反应条件：94C预变性3 min, 94C变性15 s, 5563C退火和延伸30 s, 36个循环后再72C延 伸5 min,补平PCR产物的延伸末端。M
14、MP-9 引物： 上游引物为 5&prime ;-CCT-GGA-GAC-CTG-AGA-ACC-AAT-C-3′,下游引 物为 5′-GAT -TTC-GAC-TCT-CCA-CGC-ATC-TT′。 PCR反应条件：94C预变性3 min, 94C变性30 s, 62C退火和 延伸45 s, 36个循环后72C延伸5 min,补平PCR产物的延伸 末端。MMP-2 引物： 上游引物为 5′-CGC-TCA-GAT-CCG-TGG-TGA-GA-3′, H游引物为 5′-TGT-CAC-GTG-GCG-TCA-CAG-T
15、-3′。PCR 反应条 件同RECKoβ-actin 引物：上游引物为 5&prime ;-AGC-GAG-CAT-CCC-CCA-AAG-TT-3′, 下游引物 为 5′-GGG-CAC -GAA-GGC-TCA-TCA-TT-3′0 PCR 反 应条件：94C预变性3 min, 94C变性30 s, 55C退火30 s和 72C延伸45 s, 28个循环，72C延伸5 min,补平PCR产物的 延伸末端。PCR反应体系为20 μL反应产物经含0.5 mg/L EB的 2. 5%琼脂凝胶电泳，于UVIpro凝胶图像分析系统下观察
16、并摄像， 用Image J软件扫描分析扩增条带，以目的基因条带的灰度值与 β-actin条带灰度值的比值作为目的基因mRNA的相对含 量。1. 2. 3 Western blotting法检测蛋白质 上述绒毛标本按 Trizol说明书操作抽提浓缩得到蛋白样本，用改良Lowry法测定 蛋白浓度（g/L） o蛋白样本经SDS-PAGE电泳后（采用7%分离胶）， 半干法转移至硝酸纤维素膜，封闭液中室温下水平摇床封闭1 h, 加入一抗（兔抗人MMP-2及RECK蛋白抗体为cell-singaling公 司产品，羊抗人MMP-9蛋白抗体为美国Santa公司产品,1 : 500）, 4 C过夜，弃去含有一抗的封闭液，硝酸纤维素膜置平皿加入适量TBST洗涤5 min,更换TBST重复洗3次,加入荧光二抗(鼠抗兔、兔抗羊，稀释度为1：100), 37C 1 h后，弃去二抗,TBST洗涤5 min,重复3次。奥德赛系
