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1、烟草提取物对HELF细胞中p53基因表达水平的影响及其意义摘要：已有研究表明，香烟烟雾能够影响p53基因的稳定性并诱发肿瘤。为探索 香烟烟雾是否还能影响p53基因的表达水平，开展了本课题。我们进行毒性实验。 通过应用qPCR技术，分析p53基因的转录情况。实验结果表明香烟烟雾提取物 会影响抑癌基因p53的转录，最终使其转录水平下调。提示烟草提取物可能通过 减少P53的转录水平，从而诱导肿瘤的发生和发展。关键词：HELF细胞 p53基因 转录 基因水平The role of tobacco extraction in the transcription of p53gene in HELF ce
2、llsAbstract： Studies have demonstrated that cigarette smoke can affect the stability of p53 gene and cause human cancer, especially the lung cance匚 To explore whether cigarette smoke can affect the expression of p53 gene, we conducted a toxicity experiment as well as used RT-PCR technique to analyze
3、 p53 gene transcription. The results show that cigarette smoke reduces the tumor suppressor gene p53 gene expression and may induce tumor occurrence and development through the reduction of the level of p53t transcription.Keywords: HELF cell, p53 gene, transcription, gene level引言n前，已成为世界上香烟生产和消费的超级人
4、国。政府正在拟订在公共 场所禁止吸烟的政策。吸烟以及香烟烟雾对健康产生的巨大危害己经H益引起广泛的关注。吸烟会 导致肿瘤(cancer),尤其是肺癌(hmg cancer)的发生。近年来，肺癌已成为世 界上最高发病率的肿瘤。研究表明，有90%的肺癌病人是直接或者间接的由于吸 烟而引起的【1】。除了帅癌，吸烟还会引起其他如气管癌，口腔癌，肝癌，咽喉 癌，膀胱癌，肾癌等多种癌【2】。随着2010年举世嘱H的世博会的举办，提高 我国国民对吸烟危害性的认识，有效的阻止人们在公共场所吸烟，对创造良好的 世博会环境进一步提升我国的国家形象亦将十分重要。p53是H前卅界上被研究最为透彻的一种肿瘤抑制基因(t
5、umor suppressor gene),它是一种基因调控蛋白【3】。当细胞接受到外界的不良刺激，p53被细 胞应急产生，会结合到其下游基因的启动子(promote。上，p53调控的下游基 因主要有两类，一类是与细胞周期相关，让细胞停止细胞分裂，避免己经受到损 伤的DNA复制新的DNA,把损伤的DNA传递给子代细胞扩大危害。在细胞周 期停留期，细胞会进行DNA修复；P53的另一类调控下游基因的功能是细胞凋 亡(apoptosis) 4o当细胞所承受的损伤太大而无法修复时，p53启动一些蛋白 质(酶)的表达把这些受损严重的DNA切割成小片段的DNA,细胞由此而进入 程序性的死亡，又称凋亡【5】
6、。由此可见p53是细胞内最重要的“警戒”蛋白。当细胞内的p53基因本身受到损伤时，它的“警戒”功能不能正常运行，细胞 内受损的DNA会一代乂一代的延伸下去，细胞因此而变成异常，其生长调控消 失，而演变成恶性生长的细胞【6】。据研究发现人类70%以上肿瘤都发现了 p53 基因的突变和p53蛋白质功能的片常【7】。已有的研究还表明，吸烟者的肺组织 中常伴随P53基因的点突变和缺失，烟雾通过影响小鼠肺基因P53基因的稳定性诱发肿瘤【6】。Hit*：14ttni912aZL22S Y tflLHitsia图1在第17条染色体丄P53基因表达1-100101-30030V393TranMCtivatlo
7、nDHA bindingProlww rich图2 P53蛋白示意图本研究拟通过用香烟烟雾提取物处理HELF细胞，比较不同时间长度的毒性试验 的烟草提取物处理的HELF细胞中p53基因的转录差界，从而试图揭示香烟烟雾 对P53基因表达的影响。1.材料与方法1. 1毒性实验（1）烟草提取物的制备。根据设计图1所示烟草提取装置，三通管一端连接注射器，一端通过橡皮软管与香烟相连，还有-端连接收集器。香烟(555牌)点 燃后，利用三通管将烟雾吸至注射器中，再旋转三通管，将烟雾缓慢注入收集瓶 中,收集瓶中加入100 ml的培养基。图1烟草提取装置(2) 配制一瓶含 10%血清的 Dulbeccos Mo
8、dified Eagles Medium (DMEM)-high 培养基500 mlo(3) 选用 HELF (Human Embryonic Diploid Lung Fibroblasts)细胞进行的毒性 试验。我们将HELF细胞转移至6孔细胞培养板中，每个小孔加入混有细胞的 的DMEM-high培养基2 ml,进行培养。(4) 在光学显微镜下，半细胞培养至约占小孔底面积的60%70%后，我们进 行细胞传代。首先用PBS溶液(磷酸盐缓冲溶液)洗涤细胞培养物，然后将其 吸出，再加入朕酶使其消化细胞与培养皿底部连接的蛋白，摇匀后静置1分钟， 将其吸出后，加入含有FBS(血清)与PS (双抗生索
9、)的DMEM-High培养基2 ml。(5) 我们将烟草提取溶液按照6 %的浓度(120hL)加入培养小孔内(其中有一 孔作为对照组，因此不参与毒性实验)。在实验过程中，每24吋，为防止细胞过 多，除去三分Z的细胞，进行传代，并更换烟草提取溶液。图3细胞培养6孔板(6) 在加入烟草提取物后进行计吋。当毒性实验进行6小吋，12小时，24小吋,48小吋，96小时后，我们进行RNA的抽提。1.2 RT-qPCR分析基因转录水平(1) 用 TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad CA,美国)提取 HELF 细胞中的 RNA,经过反复吹打后,加之2 ml的1.5 ml离
10、心管管中。(2) 加200gL的氯仿,剧烈震荡30s(3) 进行离心 12000rpmx 15min(4) 取上层清夜55O|iL至另一 1.5 ML离心管1.5 ML离心管管中(5) 加入500|iL的异戊醇后，离心12000 rpmxl5min(6) 弃上层清夜，加入lml的75%的乙醇，混匀，离心5min(7) 风干5min10min,加入DEPC水，反复吹吸(8) 进行RNA的电泳(9) 测定RNA浓度应用电泳技术来确定RNA含量帮助决定逆转录底物的多少Cl 6h 12h24h48h c2 Maker1OOObpI75ObpI_图4 RNA电泳应用Nano Drop來测定RNA的浓度与
11、检验是否发生蛋片污染表1 Nano Drop分析RNA浓度结果表格样本编号RNA含量(ng/ul)260/280260/230C1419.21.922. 24C2750. 11.932. 286h461.61.842. 2912h546.41.872. 3324h671.41.872. 3648h260.91. 741. 73(10) RNA的变性。将RNA在65C条件下温浴5 min,立即放于冰上冷却。(11) 用 ReverTra qPCR RT Kit 将细胞111 的 RNA 反转录成 DNA。表2反应液组成列1列2Nuclease-free WaterlOpiL5xRT Buffer
12、2|iLRT Enzyme Mix0.5pLPrimer Mix0.5pLRNA根据样本中RNA浓度确定（O.5pg-lgg）（12）逆转录反应%1 在37C条件下进行15min进彳亍逆转录反应%1 在98C条件下进行5min酶失活反应（13）qPCR 反应%1 引物设计（上海捷瑞生物工程有限公司合成）p53基因：Sense 5Z- ATATGAGCATCGAGCTCCCTCT3Antisense 5CACAACTGCACAGGGCATGT3P-actin： Sense 5 GGG A A ATCGTGCGTG AC AT3Antisense 5CAGGAGGAGCAATGATCTT3【7%1
13、 反应程式的设计表3 qPCR反应程式步温度时间变性95C30s退火95C10s （40个循环）延伸58 C30s2.结果（1）通过Realtime-qPCR,我们得到p53基因与卩-actin的Ct值。（2）根据表达水平的公式计算得到p53基因的表达水平。表达水平=2AACt=ACt （烟草处理样品）一ACt （对照组样詁）Ct=p53 基因 Ct 值一P-actin Ct 值1.6烟草提取物处理细胞时间图5经过不同时间段烟草处理的p53基因表达水平3讨论通过数据分析与图表，我们可以获知p53基因受到刺激的初期有一个忍耐 度，但一超过该忍耐度就会在短时间内产生应激反应，导致其其基因转录水平的
14、 迅速升高，但是经过长时间会导致其转录表达逐渐缓慢降低。由此可见吸烟对于 人体的危害是如此之大，若长久吸食香烟还可能会引起p53基因的突变或是甲基 化，从而影响p53基因的警戒功能。4.感谢与体会在此由衷感谢复旦大学CEE未来科学家夏令营给予我此次宝贵的学习机会。 同时也向我的指导老师卢大儒教授致谢，他在实验过程与设计小对我付出极大的 关心与帮助。另外，感谢在实验操作过程之中向我伸出援助之手的边英男博士与 周芳芳老师，以及实验室的全体工作人员。通过此次难能可贵的学习经历，我充分认识到科学研究是一项十分严谨的工 作。完成一 个课题需要阅读大量文献，并经过深思熟虑，设计好完备的实验方案，。 投身于
15、此需要我们的勇气与努力，只有通过持之以恒，百折不挠的精神，我们才 能够领悟科学研究的魅力。5.参考文献【1】邓笑伟。吸烟与肺癌有多大的关系。养生大世界：A版，2008； 7： 41。2张宇。三成以上癌症与吸烟有关。中外健康文摘，2008； 9： 75o【3】郝晓丽。P53基因的研究进展。陕西医药杂志。1999年6月第28卷第三期。 【4】顾其华。吸烟与肺癌p53基因突变的关系。国外医学，生理，病理学与临 床分册，2002.12,第22卷第6期。【5】顾岩，孙勤暖，付秀华，李国华，王立红，霍小东。突变型p53、MDM2、 caspase-3在非小细胞肺癌的表达及意义。内蒙古医学院学报，2009； 31 (1)： 29-35.【6】李若葆，黃琰，王金平，薄其付，李洪先。长期吸烟对肺癌癌旁及周围 肺组织结构和P53、VEGF蛋白表达的影响。医学研究朵志，2009； 38 (3)： 24-277 贺宇。肿瘤标志物临床应用研究现状。实用医技杂志。2006； 13 (7)： 1
