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1、维生素C增强As2 O3 诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡的研究 摘要目的: 探讨维生素C是否能 影响 三氧化二砷（As 2 O3 ）诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡，以及它对细胞内端粒酶活性的影响。 方法 : 用噻唑蓝（MTT）法筛选出维生素C的最佳浓度250molL -1 ，并用该浓度联合不同浓度的As2 O3 同时处理HeLa细胞后，用光镜、MTT法和流式细胞术 研究 细胞生长和凋亡的情况，用TRAP.ELISA法检测细胞内端粒酶活性的变化。 结果: 单独1molL -1 As2 O3 处理过的细胞生长未受到明显抑制，但联合250molL-1 维生素C处理细胞，则细胞生长受到抑制，且部分细胞出现凋亡
2、形态学特征。2、5、10molL-1 As2 O3 联合维生素C用药组的细胞凋亡率也比单独用As 2 O 3 组明显增高，且出现凋亡的时间提早。端粒酶活性检测结果提示，联合用药组细胞内端粒酶活性均明显比单独用As2 O3 组低。 结论: 小剂量维生素C能增强As2 O 3 诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡，并能增强As2 O3 对细胞内端粒酶活性的抑制作用。关键词 维生素C;三氧化二砷;HeLa细胞;细胞凋亡;端粒酶维生素C是 自然 界广泛存在的一种抗氧化剂，但近来研究表明维生素C不仅有抗氧化作用而且表现出一定的亲氧化作用1 。三氧化二砷（As 2 O3 ）是中药砒霜的主要成分，具有一定的抗肿瘤作用
3、。最近有研究显示维生素C可增强As 2 O3 诱导白血病细胞凋亡的作用24 ，这种增强作用被认为可能与降低细胞内还原型谷胱甘肽（GSH）水平和提高细胞内活性氧类（re-active oxygen species，ROS）水平有关3，4 ，但具体机制不十分明确。本研究小组前期的工作显示As2 O3 能诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡，这一作用可能与其抑制端粒酶活性有关5 。本研究旨在进一步研究维生素C对As2 O3 诱导HeLa细胞凋亡的影响，以及维生素C联合As2 O3 对宫颈癌HeLa细胞内端粒酶活性的影响。 1 材料和方法1.1 试剂As2 O3 （Sigma）用1mmolL-1 NaOH将其完
4、全溶解，调pH至7.2，用灭菌双蒸水配制成10mmolL-1 溶液，4贮存，使用时用RPMI1640培养液稀释为工作浓度。噻唑蓝（MTT）和HEPES购自Amresco公司，RPMI1640培养基（粉剂）购自Gibco公司，维生素C购自Sig- ma公司，小牛血清购自杭州四季青公司，TRAP.ELISA试剂盒来自Roche公司，RT.PCR试剂盒来自Promega公司。 1.2 细胞培养及形态观察HeLa细胞株购自 中国 科学 院上海细胞生物研究所细胞库，用含10%小牛血清和100Uml-1 青霉素、100Uml -1 链霉素和HEPES的RPMI1640培养液，在37、体积分数为0.05的C
5、O 2 培养箱中培养，每隔23d传代1次。实验选用对数生长期的细胞，用0.25%胰酶和0.02%EDTA混合消化液消化，用培养液稀释成单细胞悬液，以4000个细胞孔-1 接种于96孔板中，1624h用以下两种方法处理:一种单加不同浓度（1、2、5、10molL -1 ）As 2 O 3 ，另一种250molL -1 维生素C加不同浓度（1、2、5、10molL -1 ）As2 O3 ，不加药组作为空白对照，每组6个平行孔，加药后每天用相差显微镜观察并记录用药组和对照组的细胞形态变化。 1.3 MTT检测1.3.1 维生素C浓度的筛选 细胞准备方法同1.2。1624h分别按以下分组加药:2mol
6、L-1 As 2 O 3 组、2molL-1 As2 O 3 加不同浓度（62.5、125、250、500、750、1000、2000、4000molL -1 ）维生素C组和对照组（未加药），再在同样条件下培养48h后每孔加入20l MTT（质量浓度为5gL -1 ，用0.01molL -1 的PBS配制）后在同样条件下培养4h，弃去孔内液体，每孔加入150l DMSO，振荡10min，在酶标仪（Multiskan MK3.353）上测定波长为492nm处的光吸收值（A），每组设6个平行孔，取平均值，以（实验组A值.对照组A值）100% 计算 细胞存活率。实验重复3次以上。1.3.2 不同浓度
7、As2 O3 联合维生素C对细胞生长的影响细胞准备方法和药物处理方法同1.2。药物处理细胞48h后作MTT检测（同1.3.1），实验重复3次以上。1.4 流式细胞术检测选用对数生长期HeLa细胞制备成单细胞悬液，每瓶接种5105 个细胞，1624h用以下两种方法处理:一种单加As 2 O 3 （0、5molL-1 ），另一种250molL-1 维生素C加As2 O 3 （0、5molL-1 ），在此条件下培养48h后消化液消化，Hank液终止消化收集细胞;PBS洗2次，1000rmin-1 离心5min，将70%冷乙醇缓慢滴入试管，并不停震荡试管，使细胞分散固定;PBS洗涤后弃上清，加入1%T
8、riton-X.100，摇匀后静置10min，1500rmin-1 离心5min，弃上清;加入0.01%Rnase消化10min，1500rmin-1 离心5min，弃上清;加入0.005%的碘化丙锭染色15min，用300目丝网过滤后上机 分析 （FACS Vantage SE型，B.D公司生产）。每样本设立3管重复样本。1.5 端粒酶活性检测端粒酶的活性检测按Roche公司提供的说明书操作。选用对数生长期HeLa细胞制备成单细胞悬液，每瓶接种510 5 个细胞，培养1624h加药处理（方法同1.2）。48h后收集细胞，用PBS洗两次，43000rmin-1 离心5min;沉淀细胞中加入端粒
9、酶提取液200l，冰上孵育30min后416000rmin-1 离心20min，取上清液（为确保无沉淀物误吸，一般只吸取150l）置于另一Eppendorf管中，-70保存;取2l上清液，再加入25l TRAP.PCR扩增液（包括正义引物TS、反义引物CX、Taq聚合酶、dNTPs、镁离子等），用DEPC水补充体积至50l，瞬时离心后在PCR仪（PTC.100，MJ Research）上延伸和扩增;PCR扩增程序为:引物延伸（2530min），端粒酶灭活（945min），扩增反应（变性9430s，复性5060s，延伸7230s，30个循环，72延伸10min）。取上述PCR产物5l，加变 性液
10、20l，混匀，置室温10min，加入225l杂交液（含地高辛标记探针），混匀后取100l加入抗生物素覆盖过的微孔板中，37混匀杂交2h;每孔加入100l过氧化物酶偶联的抗地高辛抗体（anti-DIG.POD），室温下混合反应30min;每孔加入100l POD酶的底物TMB（3，3，5，5-tetramethyl benzidine），室温下混合反应15min后加100l终止液终止反应，在酶标仪上测定450和690nm波长处的A值。A差值A=A 450 -A 690 代表细胞内端粒酶活性。阳性对照为试剂盒提供的人胚肾293细胞株的端粒酶提取液，其PCR产物经ELISA检测，A1.5为阳性。阴性
11、对照为HeLa细胞提取液，于65加热10min以灭活端粒酶，其PCR产物经ELISA检测，A0.05（图2A）。同时我们在检测单独不同浓度的维生素C对HeLa细胞的影响时发现，单独500molL-1 维生素C也能诱导HeLa细胞凋亡（结果将另文发表），而单独250molL -1 维生素C却不能诱导HeLa细胞凋亡，因此我们选定250molL-1 维生素C作为我们的联合用药浓度。2.2.1.2 不同浓度As 2 O3 联合维生素C对细胞的影响 经不同浓度的As2 O3 单独处理HeLa细胞48h，以及其联合250molL-1 维生素C处理HeLa细胞48h后进行MTT检测。我们发现，单独1mol
12、L-1 的As2 O3 作用于HeLa细胞48h对细胞增殖影响不十分明显，但联合250molL-1 维生素C作用后细胞存活率则明显降低;2、5、10molL-1 的As2 O 3 联合250molL-1 维生素C处理细胞的存活率均比单独As 2 O3 处理组低，且随着As 2 O3 浓度的加大差异越来越显著（图2B）。1.对照组（为100%）;2.2molL-1 As2 O 3 组;310.分别对应2molL-1 As2 O3 联合62.5、125、250、500、750、1000、2000、4000molL -1 维生素C组 A.不同浓度维生素C联合2molL-1 As 2 O3 对细胞 的影响B.不同浓度As2 O3 单独或联合250molL-1 维生素C对细胞的影响（对照组为100%）图2 维生素C和As2 O3 对HeLa细胞生长的影响2.2.2 流式细胞术检测HeLa细胞经As2 O3 和维生素C处理（详见1.4）48h后，作流式细胞分析发现对照组（0molL-1 As2 O3 ）、单独250molL -1 维生素C处理组未出现DNA含量明显低于G1 期的亚G
