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1、付瑞玲毕业答辩课件,硕士研究生： 付瑞玲 导 师： 范雄林 副教授,结核杆菌特异抗原CFP21和MPT64 融合蛋白的重组表达、纯化及其免疫原性,付瑞玲毕业答辩课件,研究背景,付瑞玲毕业答辩课件,Estimated TB incidence rates, WHO 2004,0 - 24,25 - 49,50 - 99,100 - 299,No estimate,300 or more,Estimated new TB cases (all forms) per 100 000 population,结核病(TB)是经呼吸道传播的、严重危 害全球人类健康的重大公共卫生问题,付瑞玲毕业答辩课件,全
2、球感染者占总人口的1/3； 我国感染人数5.5亿； 感染者发展为结核病的可能性为5-10%； 缺乏特异的诊断方法； 缺乏有效的疫苗,我国和全球结核杆菌感染者,付瑞玲毕业答辩课件,3. 值,潜伏感染者的筛检和预防措施,筛检方法： 非特异性TST的活性成份是纯蛋白衍生物(PPD)，一种结核分枝杆菌非特异的混合物,其检测结果可被目前临床上广泛使用的疫苗卡介苗免疫所干扰。 较特异性 更特异性无,预防疫苗：无,付瑞玲毕业答辩课件,研究目的,1 建立更加特异 2 寻找发展感染清除疫苗的适宜靶抗原,付瑞玲毕业答辩课件,3. 值,结核杆菌特异抗原的选择,付瑞玲毕业答辩课件,保护性抗原如CFP21、MPT64，
3、分别能够刺激强 的迟发型变态反应和诱导结核病人和他们的接触者的外周血产生高水平的干扰素,重组表达CFP21和MPT64的融合蛋白，建立了全血IFN-水平分析技术(rCM-WBIA)， 检 测LTBI的 以及评估该蛋白作为感染清除疫苗靶抗原的可能性,CFP21和MPT64蛋白,付瑞玲毕业答辩课件,研 究 人 群,注:所有参与者均为自愿。,付瑞玲毕业答辩课件,实验流程,付瑞玲毕业答辩课件,IPTG诱导,受试者,TST-,TST,rCM-TST-,rCM-TST+,rCM+TST-,rCM+TST+,rCM+TST+,TST,健康者,密切接触者,付瑞玲毕业答辩课件,研究结果,付瑞玲毕业答辩课件,Ta
4、ble1 Primer list and thermal cycle parameters for cloning of M.tuberculosis recombinant antigens,Antigen Primer orientation and sequence （5-3） PCR parameters Amplicon size,CFP21 F A A G G A T C C G A T C C G T G T T C G G A C A T C G C G G T C G R:GCTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCTCCGGCG
5、TGATCGAGCCTGTTCGCC,94 for 5 min Then 30 cycles 94 for 1 min 60 for 1 min 72 for 45 s Then 72 for 5 min,608 bp,Mpt64 F:GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGT GGCGGCAGCGCGCCCAAGACCTACTGCGAGGAG R:GAAAGCTTCTAGGCCAGCATCGAGTCGATCGC,94 for 5 min Then 30 cycles 94 for 1 min 60 for 1 min 72 for 45 s Then 72 fo
6、r 5 min,671 bp,rCMF CFP21F rCMR MPT64R,94 for 5 min Then 30 cycles 94 for 1 min 60 for 1 min 72 for 90 s Then 72 for 10 min,1234bp,付瑞玲毕业答辩课件,Fig.1 PCR results and the identification of the recombinant plasmid pPro2164. Lane 1, the recombinant plasmid pPro2164 digestion with BamHI and HindIII; Lane 2
7、, PCR result of the fusion gene fragment encoding CFP21 and MPT64 with a 45bp linker; Lane 3, PCR result of the gene encoding mature MPT64; Lane 4, PCR result of the gene encoding mature CFP21; M represents DNA molecular marker.,1.克隆原核表质粒,付瑞玲毕业答辩课件,Fig.4. IPTG induction of rCM in recombinant E. coli
8、 BL21(DE3). Lane 1, protein weight marker; Lane 2, protein expression in E. coli not induced with IPTG; Lane 3, protein expression in E. coli 4 hours post IPTG induction; Lane 4, protein expression in E. coli6 hours post IPTG induction. Fig. 2B. Western blot analysis.,利用 rabbit anti-His6 antibody 和化
9、学发光技术,2.SDS-PAGE Western blot,付瑞玲毕业答辩课件,蛋白纯化,Fig.5. Purification of M. tuberculosis rCM in recombinant E. coli BL21. Lane 1, Marker Lane 2 ,supernatant after wash with Denaturing Binding Buffer; Lane 3, supernatant after wash with Denaturing Wash Buffer; Lane 4, supernatant after wash with Native Wa
10、sh Buffer; Lane 5, purified elution with Native Elution Buffer.,付瑞玲毕业答辩课件,试验方法的确立,付瑞玲毕业答辩课件,超过500pg/ml的人为感染者或患者；低于500pg/ml为非感染者。,IFN-水平cut-off 值的确立,PBS刺激IFN- 水平的平均值为30 15pg/ml,PHA刺激IFN- 水平的平均值为5407.3 4593 pg/ml 健康的TST-的未暴露人群（n=40）的的IFN- 水平的平均值 为250110 pg/ml,500 pg/ml设为IFN- 分析的cut-off值,付瑞玲毕业答辩课件,Fig.
11、7. rCM-WBIA分析不同人群产生的IFN-水平,。,22401062,250110,14501179,付瑞玲毕业答辩课件,表1 TST 与 rCM-WBIA分析结果的比较,付瑞玲毕业答辩课件,表2 rCM-WBIA诊断密切接触者的结果,#：Kappa值在0.45-0.75为中、高度 一致， Kappa值0.75为极好的一致性。,付瑞玲毕业答辩课件,rCM-WBIA分析密切接触者的结果,Fig .9. Comparison of TST and rCM-WBIA. The cut-off value for rCM-WBIA positive was calculated from 40
12、healthy unexposure persons and was set at 500pg/ml. A total 36 household contacts could be classified into four catalogues depending on the cut-off value.,付瑞玲毕业答辩课件,TST硬结直径与IFN-释放的关系,Fig.10. TST硬结直径与IFN-释放的关系 A：表示TST-组与TST+组和TST+组之间IFN-释放量都有显著性差异。 B：表示TST+组与TST-组和TST+组之间IFN-释放量都有显著性差异。 C：表示TST+组与TST
13、+组和TST-组之间IFN-释放量都有显著性差异。,付瑞玲毕业答辩课件,讨 论,目的基因的获取：在设计中运用GeneSOEing技术通过引入Linker 序列构建CFP10-MPT64融合基因，并构建基因表达质粒pProEXHTb- CFP10-MPT64。该技术对两个和多个基因的拼接十分有效，能保证重组基因片段的完整性和与原序列的一致性。Linker序列具有良好的柔韧性和折叠性，并有足够的长度保证融合抗原中CFP10和MPT64形成与天然抗原类似的空间结构，从而形成具有各自抗原性较大的分子量的融合抗原。,表达载体的选择：原核表达载体pProEXHTb所表达的重组蛋白带有的6个连续组氨酸残基，
14、可结合在Ni2+-NTA柱上，又因咪胍可竞争地结合在Ni2+-NTA柱上而将重组蛋白置换下来融合蛋白的提取纯化提供了一种有效方法。,rCM-全血IFN-分析在结核病患者和感染者诊断中的意义TST和rCM-WBIA分析分别诊断此次密切接触人群中LTBI 的感染率分别为61.1%和66.7%。与常规的TST比较， rCM-WBIA检测LTBI的灵敏度（90.9）和特异度（71.4）。rCM-WBIA和TST的总体一致率高达83.3%，显示了良好的诊断一致性(k =0.64)。该新方法操作简单，结果产生快，适用于多数低发达国家，具有较大的实践推广价值和应用价值。,付瑞玲毕业答辩课件,rCM-WBIA分析适用范围,rCM-WBIA分析存在的问题,讨 论,rCM也可以作为清除感染者体内病菌的候选靶抗原：rCM 融合蛋白刺激TST不同程度TST阳性人群产生的IFN-水平有很强的相关性，机体产生的抗原特异的IFN-，可活化巨噬细胞，而最终导致对巨噬细胞内的病原体的杀伤。,付瑞玲毕业答辩课件,感谢我的导师范雄林教授！ 感谢病原微生物系的老师和同学！ 感谢医药卫生管理学院陶红兵教授！ 感谢在座的各位教授与同学！,Thank you !,
