分类号：Q 9 3 密级： 单位代码： 1 0 4 2 2 学号：2 0 0 8 1 1 3 5 2 ∥紫办写 硕士学位论文 论文题目：以葡萄糖为唯一碳源合成聚( 3 ．羟基丁酸 酯⋯C O4 羟基丁酸酯) 的研究 B i o s y n t h e s i so fp o l y ( 3 ·h y d r o x y b u t y r a t e - c o - 4 一h y d r o x y b u t y r a t e ) f r o m E s c h e r i c h i ac o i lu s i n gg l u c o s ea ss o l ec a r b o ns o u r c e 作者姓名 专业 指导教师姓名 杜丽丽 微生物学 专业技术职务 祁庆生教授 2 0 11 年5 月2 3日 I l l l l l lI I I I I1 1 1 1I I f lI Il 原创性声明 } Y 1 9 3 7 5 7 0 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。
对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明本声明 的法律责任由本人承担 论文作者签名：日期：塑! ! ：鱼：三多 关于学位论文使用授权的声明 本人同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的印刷件 和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：耋虹导师签 山东大学硕士学位论文 目录 摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯I A b s t r a c t ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯I I I 缩写词表( A B B R E V I A T I O N ) ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯V 第一章绪论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 1 ．1 生物可降解材料概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l 1 ．2 聚羟基脂肪酸酯( P H A ) 概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1 1 ．2 ．1P H A 的结构及分类⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2 1 ．2 ．3P H A 的分析方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．5 1 ．2 ．3 ．1 染色法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6 1 ．2 ．3 ．2 气相色谱法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．6 1 ．2 ．3 ．3 高效液相色谱法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。
6 1 ．2 ．3 ．4 核磁共振法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7 1 ．2 ．4P H A 应用前景⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7 1 ．2 ．4 ．1P H A 作为生物可降解材料的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7 1 ．2 ．4 ．2P H A 在医学和组织学上的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．8 1 ．3P ( 3 H B ．c o - 4 H B ) 简介⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8 1 ．3 ．1P ( 3 H B ．c o - 4 H B ) 结构、性质及功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8 1 ．3 ．2P ( 3 H B - c o - 4 n B ) 生物合成途径⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1 l 1 ．4 本论文的目的和意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 4 第二章实验部分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1 5 2 ．1 实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 5 2 ．1 ．1 菌株和质粒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 5 2 ．1 ．2 试剂及培养基⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。
l6 2 ．1 ．2 ．1 常用试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 6 2 ．1 ．2 ．2 溶液配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l6 2 ．1 ．2 ．3 培养基配方⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯17 2 ．1 ．3 仪器和设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 9 2 ．2 实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 0 山东大学硕士学位论文 2 ．2 ．1 重组质粒的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一2 0 2 ．2 ．1 ．1 引物设计⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 0 2 ．2 ．1 ．2P C R 克隆基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 0 2 ．2 ．1 ．3P C R 产物的回收⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 l 2 ．2 ．1 ．4 质粒提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 l 2 ．2 ．1 ．5P C R 片段和质粒的限制性内切酶酶切⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 2 2 ．2 ．1 ．6 酶切产物的胶回收⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 3 2 ．2 ．1 ．7P C R 片段与质粒的连接⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 3 2 ．2 ．1 ．8 大肠杆菌普通感受态细胞的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 3 2 ．2 ．1 ．9 大肠杆菌转化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 4 2 ．2 ．1 ．1 0 重组子的筛选与验证一两步法简单提质粒法⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 4 2 ．2 ．2S a d 基因的敲除⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 4 2 ．2 ．2 ．1 引物设计⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2 4 2 ．2 ．2 ．2 电转感受态细胞的制备及基因敲除⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 5 2 ．2 ．2 ．3 重组子的筛选与验证一菌落P C R 验证⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 6 2 ．2 ．2 ．4 去除W 3 1 1 0 ／A s a d 菌株的k a n 抗性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2 6 2 ．2 ．3 重组大肠杆菌产P ( 3 H B ．c o - 4 H B ) 的发酵培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯～2 6 2 ．2 ．3 ．1 有氧发酵⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2 6 2 ．2 ．3 ．2 厌氧发酵⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 7 2 ．2 ．3 ．3 两阶段发酵⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 7 2 ．2 ．4 发酵产物的各项检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．2 8 2 ．2 ．4 ．1O D 6 0 0 的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 8 2 ．2 ．4 ．2 葡萄糖含量的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2 8 2 ．4 ．4 ．3 高效液相色谱法( H P L C ) 测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2 8 2 ．2 ．4 ．4 气相色谱法( G C ) 检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 8 2 ．2 ．4 ．5 气相色谱．质谱联用( G C ／M S ) 检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。
2 9 2 ．3 实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 9 2 ．3 ．1 重组质粒p C C S 4 及p C S 4 的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 9 2 ．3 ．2 重组大肠杆菌厌氧发酵培养分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 2 山东大学硕士学位论文 2 ．3 ．3 重组大肠杆菌发酵产物鉴定分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．3 4 2 ．3 ．3 重组大肠杆菌的厌氧发酵优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．3 5 2 ．3 ．4 敲除大肠杆菌W 3 儿0 中的s a d 基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 8 2 ．3 ．5 重组大肠杆菌有氧发酵培养分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 9 2 ．4 小结与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 1 参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 3 致i 射⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 9 攻读学位期间发表的学术论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．5 0 学位论文评阅及答辩情况表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。
51 山东大学硕士学位论文 摘要 聚羟基脂肪酸酯( P H A ) 是一类微生物在胞内积累的碳源和能源储存物质， 具有生物可降解性、热可塑性，生物相容性，光学活性，和压电特性等因此， P H A 作为生物可降解塑料被认为是解决由大量废弃塑料造成的环境污染问题的 希望，而且P H A 作为一种新型生物工程材料，在工业、农业、食品业、医药学、 精细化工中也极具应用前景 聚3 一羟基丁酸[ P ( 3 I - I B ) 】是P H A 中最常见的一种，也是研究和了解得最透 彻的一种但是由于其质地发脆，发硬，难于加工，其应用范围和价值受到了很 大的限制如果再其中插入4 ．羟基丁酸( 4 I - I B ) ，形成聚( 3 ．羟基丁酸酯一c D 4 ． 羟基丁酸酯) [ P ( 3 H B - c o - 4 H B ) ] ，可以极大地改善P ( 3 I - - I B ) 聚合物这一缺点另 外，e ( 4 I - m ) 8 1 曼容易被生物体内的脂肪酶或酯酶降解，并且降解速率相对其他P H A 比较快，可用于制造医学工程材料 在前期的研究当中，P ( 3 H B —c o - 4 H B ) 的产生需要添加1 。
4 ．丁二醇、4 ．羟基丁 酸、丫- 丁内酯等直接前提物质，这些物质往往比较昂贵，这限制了e ( 3 i - m ．c o - 4 H B ) 的生产及应用后来，有研究用葡萄糖为唯一碳源来生产P ( 3 H B ．c o - 4 H B ) ，但是 4 H B 在聚合物中含量很低敲除s a d 和g a b D 基因的菌株，可以使得4 H B 在聚 合物中含量提高到1 1 ％，但是，4 H B 的含量还是有限而且用到的琥珀酸半醛 脱氢酶( s u c D ) 和4 ．羟基丁酸脱氢酶( 4 h b D ) 是氧敏感性的酶，这限制了这条代 谢途径在有氧条件下的应用考虑到原料和酶活性的问题，本研究采用在厌氧条 件下以葡萄糖为唯一碳源来合成e ( 3 I - m ．c o - 4 H B ) 已有很多研究证明，厌氧条件下通过T C A 循环的逆循环可以积累琥珀酸， 那么只要表达琥珀酰辅酶A ．辅酶A 转移酶( c a t l ) 就可以产生琥珀酰辅酶A ， 然后通过琥珀酸半醛脱氢酶( s u c D ) 、4 ．羟基丁酸脱氢酶( 4 h b O ) 、4 ．羟基丁酸辅酶 A ．辅酶A 转移酶( c a t 2 ) ，在厌氧条件下即可合成4 H B ，这样解决了s u c D 、4 h b D 氧敏感性的问题。
本研究选用高产琥珀酸的大肠杆菌工程菌株W 3 1 1 0 G A B ，其中敲除了p t s G ， l d h A 、棚三个基因，并且采用基因工程手段，外源表达c a t l 、s u c D 、4 h b D 、c a t 2 基因，使得大肠杆菌能够在厌氧条件下以葡萄糖为唯一碳源来合成 P ( 3 H B ．c o - 4 H B ) ，验证了该途径积累e ( 3 m 3 ．c o - 4 H B ) 的可行性 山东大学硕士学位论文 本研究采用厌氧发酵生产P ( 3 H B ．c D —4 H B ) 的新方法，解决了传统研究中4 H B 的生产与s u c D 、4 h b D 酶活不高之间的矛盾，。