DSS诱导的结肠炎是由NLRP3炎症小体介导的摘要：背景：前炎性细胞因子IL-1β、IL-18在炎症性肠病的发病中起着重要作用，在应对多种微生物和晶质的反应中，两种细胞因子都通过caspase-1激活的多种蛋白复合体的处理，这种多蛋白复合体就是炎症小体（NLRP3），在此我们将会研究NLRP3在DSS诱导的结肠炎小鼠中的作用方法：应对DSS诱导产生的IL-1β，我们对野生型、Caspase-1-/-、NLRP3-/-、ASC-/-、Cathepsin（组蛋白酶） B-/-、Cathepsin L-/-小鼠的巨噬细胞进行研究C57BL/6和NLRP3-/-小鼠通过口服DSS进行诱导，每天进行临床疾病活动指数评分，确定结肠的组织损伤的严重程度和细胞因子的表达结果：在体外用DSS刺激巨噬细胞以Caspase-1依赖的途径分泌较高水平的IL-1βIL-1β的分泌可被敲除NLRP3、ASC或Caspase-1所阻断，表明DSS激活Caspase-1是通过NLRP3炎症小体另外，IL-1β的分泌还依赖于吞噬作用、溶酶体成熟、组蛋白酶B和L以及活性氧，在灌胃DSS之后，NLRP3-/-小鼠相比于野生型小鼠产生较弱的结肠炎症并在结肠组织中产生的前炎性因子的水平比较低。
用药物Pralnacasan抑制Caspase-1相比于NLRP3缺陷具有相似的黏膜保护作用结论：NLRP3在DSS诱导的小鼠肠道炎症中发挥着重要作用NLRP3炎症小体可作为IBD病人新的治疗作用的潜在靶点这项研究的意义：关于这个领域有哪些是已知的？1、 前炎性细胞因子IL-1β和IL-18在IBD发病中所起到的重要作用2、 IL-1细胞因子家族的激活和分泌是由NLRP3炎症小体来调节3、 单核苷酸多态性： NLRP3基因区和其他的炎性相关基因的单核苷酸多态性与克罗恩疾病的易感性相关最新的发现有哪些：1、 运用DSS诱导的急性结肠炎模型，我们发型NLRP3炎症小体缺乏的小鼠具有对结肠炎明显的保护作用2、 我们发现DSS对巨噬细胞的NLRP3炎症小体在体内外都具有激活作用3、 IL-1β的分泌依赖于对DSS大分子的吞噬作用、溶酶体的成熟、组蛋白酶B和L以及活性氧对可预见的未来临床应用的影响：NLRP3炎症小体可作为治疗IBD的潜在的新的靶点简介：人类炎症性肠病（IBD），主要是溃疡性结肠炎和克罗恩病，是由慢性胃肠道黏膜免疫系统失调所引起的慢性的、周期性复发和恢复的炎症状态IBD的确切的发病机制仍未完全的了解。
但是，被广泛接受的是基因和环境因素都参与其中结肠炎实验动物模型被建立应用于研究IBD发病的分子和细胞机制，并且这些模型被广泛应用于新型抗炎药物的开发和活性评价在DSS诱导的急性结肠炎小鼠模型中，饲喂小鼠含有DSS多聚物的饮用水，可诱导腹泻、血便、体重下降、炎症和溃疡的组织学切片（人类IBD也会发生的状态）为特征的肠炎因为急性肠炎反应不依赖于T、B细胞这个模型主要应用于固有免疫对肠道炎症的作用，这可能与DSS对粘膜的毒性作用和上皮屏障功能失调相关前炎性细胞因子包括IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α在活动性IBD中都能检测到并且与炎症的严重程度相关IL-1β和TNF-α可改变上皮细胞的紧密连接和肠道的通透性因为上皮屏障的完整性对于阻断微生物的侵入以及对其下组织的毒性、IL-1β在级联式引起炎症结肠的早期阶段具有重要作用实际上，IL-1β在DSS诱导的小鼠结肠黏膜和腹腔巨噬细胞都有水平的升高，可以进一步代表肠道炎症的起始IL-1β和IL-18由Caspase-1激活，并且在Caspase-1-/-小鼠强烈表明Caspase-1在DSS诱导的结肠炎中起到十分重要的作用NLR（核苷酸结合区域和亮氨酸富集区域）家族，包括大量的细胞内模式识别受体。
NLRs含有亮氨酸聚集区可识别多种病原体相关分子模式NOD2和NLRP3是两种具有特点的NLR，并且这些受体的基因突变与克罗恩疾病相关NOD2识别细菌肽聚糖衍生分子胞壁酰二肽（MDP）并激活NF-κB信号通路产生炎症反应NOD2基因突变在克罗恩疾病个体中被发现这种多态性与NF-κB的激活和IL-1β的分泌相关但是，具体地NOD2、NF-κB和前炎性细胞因子Pro-IL-1β/IL-1β之间的关系仍存在争议NLRP3,作为一种cryopyrin｛cryopyrin 是核苷酸结合区域（nucleotide-binding domain, leucine-rich-repeat-containing family）｝组成了炎症小体通过衔接蛋白ASC和Caspase-1将Pro-IL-1β和Pro-IL-18转变为它们的活性形式NLRP3的突变可能导致慢性自身免疫综合征NLRP3基因的单核苷酸多态性与克罗恩疾病的易感性密切相关另外，联合NLRP3和CARD8的多态性在瑞典男性群体中与克罗恩疾病有密切关系 最近研究发现自噬蛋白 autophagy Protein Atg16LI是克罗恩疾病的进一步地易感因子。
明显地，Atg16LI缺陷引起Toll/IL-1受体包含区域适配器诱导Interferonβ（TRZF）依赖的Caspase-1的激活，造血细胞中Atg16LI缺陷小鼠DSS诱导的急性结肠炎的易感性增加，这些小鼠的IL-1β和IL-18的水平的增加和粘膜炎症的严重程度相关，表明解除对Caspase-1活性的管制在IBD和DSS诱导的溃疡性结肠炎发病中具有重要作用这项研究中，我们探究在NLRP3炎症小体基因敲除鼠科巨噬细胞中Caspase-1活性对DSS的反应另外，NLRP3炎症小体在肠道炎症中的作用通过DSS诱导的急性肠炎模型来研究方法：细胞培养和试剂：WT、Caspase-1-/-、NLRP3-/-、ASC-/-、Cathepsin B-/-、Cathepsin L-/-和IPAF-/-小鼠巨噬细胞系有所述方法得到细胞用DMEM培养基，高葡萄糖，给予1%L型谷氨酸盐，10%胎牛血清和10ug/ml的环丙沙星人类单核细胞系（THP-1）培养在RPMI培养基中加入10%胎牛血清，1%丙酮酸钠，10ug/ml环丙酰胺在DSS刺激前先用佛波酯（PMA）分化3h初始人类巨噬细胞来源于正常人的附着的外周血单个核细胞（PBMCs），用RPMI+2%AB血清、1%L型谷氨酸盐，100U/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素的培养基培养，同时加入100U/ml重组人类粒细胞刺激因子（rhGM-CSF）；Caspase-1的抑制剂Z-YVAD-fmk、尼日利亚菌素(nigerincin) 、细胞松弛素D（Cytochalasin D）、博来霉素（bafilomycin A）购买于（**），多聚（dA，dT）钠盐、N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine NAC），ADPC和葡聚糖酶（dextranase）购买于Sigma-Aldrich；所有的DSS试剂购买于MP Biomedicals；超纯脂多糖LPS K2和四甲丫啶（acridine orange）购买于Invitrogen。
Caspase-1抑制剂Pralnacasan 由Sanofi-Aventis提供，聚氧乙烯蓖麻油（Cremophor EL）购买于BASF斑点形成实验（Speck formation assay）运用稳定表达ASC-CFP荧光蛋白的融合蛋白的巨噬细胞来研究含有ASC的NLRP3炎症小体的聚集细胞以1*106个/孔铺板子，用10ng/ml LPS 启动2h后用DSS共孵育24h洗完细胞后，ASC-CFP斑点的形成通过荧光显微镜分析，每个区域的斑点数目用Image J软件来分析流式细胞术（Flow Cytometry）巨噬细胞在24孔板中用DSS刺激培养24h用于溶酶体（lysosomal）的研究细胞洗过之后用1ug/ml吖啶孵育15min用于溶酶体染色，细胞系两遍后，用FACSCantoⅡ 在600-650nm发射光波长处用于荧光强度分析所得数据用FlowJo软件分析小鼠（Mice）NLRP3-/-小鼠饲养于 University of Munich ,8-16周龄小鼠用于实验年龄相匹配的野生型的对照小鼠购买于 Harlan Winkelmann，老鼠饲喂标准鼠粮，给予瓶装自来水，在开始分入试验组前先适应7天，所有的实验都经动物研究伦理会的批准，与合理运用动物与生物医学研究的指导原则相一致。
结肠炎的诱导和治疗（Induction of colitis and treatment）结肠炎的诱导是通过将DSS（分子量40KD 浓度2%）溶于饮用水中让C57BL/6和NLRP3-/-小鼠自由饮水1-9天获得，对照组小鼠给予自来水Caspase-1的抑制剂Pralnacasan 溶于聚氧乙烯蓖麻油，浓度为25%，用0.2um的过滤器滤过，药物腹腔注射，50mg/Kg每天两次，对照组小鼠腹腔注射蓖麻油每天两次临床评分和组织学评分（Clinical Score and histological analysis）体重、粪便隐血、经直肠出血和粪便硬度有两个研究者双盲评价一个评分体系用于评价腹泻、隐血、明显出血体重变化以基线水平下降的百分比来表示尸检取出结肠，结肠片段用于ex-vivo分析组织学：环切结肠组织横断面，4%的福尔马林溶液固定，石蜡包埋，根据标准操作规程部分结肠用于H&E染色，病理学家通过blinding way 的方式进行形态学评分在肠道固有层有炎性细胞数量的增多记1分，炎性细胞汇集于粘膜下层记2分，透壁性浸润记3分对于组织损伤：离散的粘膜上皮损伤记1分，粘膜侵蚀记2分，深度的粘膜损伤或深度的肠壁结构的受损记3分。
这两种等权重的评分方式（细胞浸润和组织损伤）加在一起，结肠组织学病理严重程度的评分从0分到6分体外分析结肠组织中的细胞因子（Ex vivo analysis of colonic cytokines）结肠用机械方法进行压碎，200μl组织蛋白提取试剂中涡旋1分钟，用液氮冷冻4℃条件下10000g离心15min匀浆液提取总蛋白用BioRad 蛋白试剂进行定量结肠匀浆中的IFN-γ，IL-1β和TNFα用ELISA的方法进行定量mRNA的提取和逆转录PCR（mRNA extraction and reverse transcription-PCR，RT-PCR）结肠组织用PBS冲洗干净，用液氮迅速冷冻，并存储在-70℃条件下匀浆组织中总的RNA用Vltra Turrax 仪器和Roche总RNA组织提出试剂盒提取获得RNA的总量和纯度用分光光度法来检测，并稀释成统一浓度逆转录反应体系：M-MLV逆转录酶（**公司），RNA水解酶抑制剂（**公司），低聚脱氧胸苷（dT）用于cDNA合成（**公司）光循环仪和DNA掺杂荧光染料（Fast start DNA Master SYBR Green I kit）用于实时PCR，依据试剂厂商的操作说明进行。
鼠科磷酸甘油醛脱氧酶基因引物（GAPDH，glyceraldehyde phosphate delydrogenase）和IP-10（CXCL-10）的引物作为光循环系列中的标准DNA，每个样本的拷贝数都与GAPDH的拷贝数相关分离腹腔巨噬细胞（Isolation of peritoneal macrophages）在异丙烷全身麻醉的条件下颈椎脱臼（cervical dislocation）处死小鼠，腹腔内注射10mlPBS溶液，摇晃后，进行腹腔灌洗（peritoneal lavage），收集腹腔灌洗液，红细胞用红裂液裂解剩余的细胞种在细胞培养板上过夜，粘附的细胞用于细胞因子的检测SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western 。