附件5免疫毒性试验方法Immunotoxicity test1 范围本方法规定了动物免疫毒性试验的基本原则、要求和方法本方法适用于化妆品原料的免疫毒性检测 2 试验目的 本方法用于评价化妆品原料免疫毒性反应的潜在可能性3 定义3.1 免疫毒性 immunotoxicity受试物对机体免疫系统结构与功能造成损害作用的能力，包括机体免疫系统的组织或器官损伤、免疫功能的抑制或增强3.2 体液免疫 humoral immunity抗原进入机体后，刺激B细胞产生效应B细胞和记忆细胞，进而产生抗体，与相应的抗原产生免疫反应3.3 细胞免疫 cell-mediated immunity又称细胞介导免疫狭义的细胞免疫仅指T细胞介导的免疫应答，即T细胞受到抗原刺激后，分化、增殖、转化为致敏T细胞，对抗原的直接杀伤作用及致敏T细胞所释放的细胞因子的协同杀伤作用T细胞介导的免疫应答的特征是出现以单核细胞浸润为主的炎症反应和/或特异性的细胞毒性广义的细胞免疫还包括原始的吞噬作用以及NK细胞介导的细胞毒性作用4 试验的基本原则本方法用于评价受试物是否改变或损伤免疫系统的机能状态免疫毒性试验应分层级开展，初始筛选免疫毒性试验是在重复剂量毒性试验免疫毒性相关检查基础上增加淋巴细胞亚群分布、免疫球蛋白含量测定等项目。
初始筛选试验提示存在免疫毒性风险时，则需开展附加免疫毒性试验附加免疫毒性试验时，给予不同剂量组受试物至少28 d，每天对动物进行观察，记录所出现的任何临床毒性表现给予受试物结束后处死动物，对相应的评价指标进行检测或分析5 初始筛选免疫毒性试验5.1 初始筛选试验方法采用初始筛选免疫毒性试验，对受试物潜在免疫毒性进行初步评估初始筛选试验可整合至重复剂量毒性试验中为发现免疫毒性指征，需评价以下指标：（1）血液学检查：白细胞总数及分类计数等2）血液生化检查：球蛋白、白蛋白/球蛋白比值3）大体病理学检查：淋巴器官/组织4）脏器重量/脏器系数：胸腺、脾脏的湿重，必要时可选代表性淋巴结进行称重，并计算脏器系数5）组织病理学检查：胸腺、脾脏、骨髓（股骨、胸骨或肋软骨部位的骨髓）、有代表性的淋巴结（黏膜附近或周围淋巴结）、所有肉眼可见的损伤此外，免疫毒性初始筛选试验还应增加以下指标的检测：（1）免疫球蛋白分类（IgG、IgM、IgA和IgE）水平测定2）淋巴细胞亚群测定：该试验属于免疫表型分析，目的是对淋巴细胞亚型进行鉴定和计数，通常采用流式细胞仪测试对全血、外周血或从淋巴组织分离的免疫细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞等进行计数；检测免疫细胞表面标志物的改变，评估CD4+和CD8+T淋巴细胞或其它亚群的数量及比值。
5.2 试验结果的评价 初始筛选试验结果，应基于淋巴细胞亚群分布、免疫球蛋白分类的结果，并考虑重复剂量毒性试验中的免疫毒性相关检查，如血液学、血清免疫球蛋白含量、免疫器官重量、组织病理学（胸腺、脾、淋巴结）等结果进行综合评价上述检查项目出现异常时，即受试物各剂量组与溶剂对照组比较存在统计学上的显著差异（但应考虑动物正常的参考范围和变化，存在毒理学意义的改变），提示受试物存在潜在免疫毒性风险，应开展附加免疫毒性试验研究，以验证受试物潜在的免疫毒性，并明确免疫细胞和免疫功能受影响的程度6 附加免疫毒性试验附加免疫毒性试验包括：体液免疫、特异性细胞免疫、巨噬细胞检测、NK细胞活性四个方面，每个方面应至少选择一种试验方法进行6.1 体液免疫试验给予受试物后用抗原免疫动物，采用抗体形成细胞试验（也称溶血空斑试验）方法或酶联免疫吸附（ELISA）检测抗体滴度的方法评价受试物对体液免疫的影响6.1.1 抗体形成细胞试验（Antibody Plague Forming Cell，PFC）6.1.1.1 受试物固体受试物应溶解或悬浮于合适的溶剂中，临用前稀释至适当浓度；液体受试物可以直接加入试验系统和/或临用前稀释至适当浓度。
受试物应在临用前新鲜配制，否则须确认贮存不影响其稳定性6.1.1.2 实验动物及饲养环境6.1.1.2.1 动物种系的选择选用健康啮齿类动物，推荐使用小鼠（近交系）或大鼠如果已知受试物对其中一种性别的动物更敏感，则应使用这种性别的动物雌性动物应未孕、未产试验开始时每一性别的动物体重差异应控制在± 20%内6.1.1.2.2 动物的性别和数量 每一个剂量组和对照组至少应该有20只动物（雌雄各半）若计划在试验过程中处死动物，则应增加计划处死的动物数6.1.1.2.3 饲养环境实验动物和实验动物设施应符合国家相应规定选用标准配合饲料，不限制饮水量6.1.1.3 剂量分组至少要设三个剂量组、一个溶剂对照组和一个阳性对照组，如果受试物采用未知免疫毒性的溶剂时，还应设立一个不作任何处理的空白对照组高剂量应不使动物产生明显的应激、营养不良或死亡，但最好可使动物产生一些可测量的一般中毒表现低剂量最好不使动物产生任何免疫毒性作用阳性对照组可选用已知的免疫抑制剂（如环磷酰胺等）作为阳性对照物6.1.1.4 受试物给予开始给予受试物前至少要有3 ~ 5 d时间使实验动物适应实验室饲养环境实验动物随机分组受试物或溶剂经口和/或经皮和/或经吸入给予，给予受试物途径一般与90 d重复剂量毒性试验的途径一致。
每周给予受试物7 d，至少28 d6.1.1.5 临床观察试验期间，每天对动物至少进行1次临床观察，记录毒性症状的出现时间、严重程度及其持续时间观察应包括但不限于以下方面：皮肤、被毛；眼、黏膜；呼吸系统；自主性和中枢神经系统；循环系统；肢体运动功能；行为特征；抗感染能力等每周测量1次动物的摄食量动物给予受试物前称体重，之后每周1次，处死前再次称体重任何濒死动物一被发现应与其他动物分开并被安乐死对试验过程中任何濒死的或死亡的动物都应进行大体解剖6.1.1.6 试验方法给予受试物结束前4 d，经静脉注射T细胞依赖性抗原绵羊红细胞（SRBCs），通过计数动物脾脏中特异性抗体生成细胞的数量来反映抗体的产量，可用于检测受试物对脾脏内产生抗体的细胞的毒性作用试验时，应考虑如下因素：（1）注射T细胞依赖性抗原SRBCs，应对动物注射抗原后测定PFC的最佳时间作出评价2）测定每批补体的活性3）使用双盲法进行PFC计数4）测定脾细胞的活性6.1.2 免疫球蛋白定量测定6.1.2.1 受试物、实验动物、剂量分组、受试物给予方式及临床观察同6.1.1.1 ~ 6.1.1.56.1.2.2 试验方法在给予受试物结束前4 d，用牛血清白蛋白免疫动物，2周后再次用抗原免疫动物，然后测定每只动物血清中IgG和IgM的滴度。
测定抗体滴度的时间点应足够多（通常选择3 ~ 5个），以便对受试物组和对照组动物的初级抗体反应和次级抗体反应进行比较测定抗体时受试物的给予时间至少为28 d试验时，应考虑测定血清中IgG和IgM滴度的方法应足够敏感以便测得每只动物的IgG和IgM滴度该试验评价受试物是否影响抗体对抗原的反应性6.2 特异性细胞免疫试验采用下列3种试验方法中的任一种进行试验，评价给予受试物至少28 d对特异性细胞免疫反应的影响如选择淋巴细胞增殖试验或细胞毒性T淋巴细胞检测，可与NK细胞活性共用一组动物6.2.1 淋巴细胞增殖试验6.2.1.1 受试物、实验动物、剂量分组、受试物给予方式及临床观察同6.1.1.1 ~ 6.1.1.56.2.1.2 试验方法可通过测量放射性标记物（一般为3H-胸腺嘧啶，简称3H-TdR）掺入DNA的量来说明淋巴细胞的增殖，也可采用MTT、BrdU-ELISA/FCM法等方法该方法可以证明给予受试物至少28 d对同种异品系淋巴细胞刺激引起的淋巴细胞增殖能力的影响采用3H-TdR掺入试验时，应对如下因素进行考虑：（1）应答细胞来自对照组和受试物组动物的脾细胞，在无菌条件下制备脾细胞。
应答细胞的DNA合成没有采取阻断处理2）刺激细胞来自未给予受试物的同种异品系动物的脾细胞，在无菌条件下制备脾细胞刺激细胞的DNA合成用丝裂霉素或X线处理进行阻断3）测定应答细胞和刺激细胞的活力4）应设3份或4份对照，保证刺激细胞的非反应性、测定DNA合成的基础水平5）对空白对照和溶剂对照同时进行测定6）用每个培养皿中掺入应答细胞的放射性标记物的量来表示脾细胞的增殖程度，表示为每分钟居里数（curie per minute，CPM）要计算净CPM（nCPM），即应答细胞被刺激细胞刺激后掺入的CPM均值减去未经刺激的脾细胞掺入CPM的均值受试物组与对照组差异的百分比表示为：[1-（受试物组nCPM/对照组nCPM）]7）不同的淋巴细胞增殖试验存在许多不同，应说明所引用的试验方法及详细的试验步骤，说明主要试剂的来源，最好也说明这些试剂的纯度8）为了证明方法的灵敏性，应设立阳性对照组，给予已知的免疫抑制剂6.2.2 迟发型过敏（Delayed -type Hypersensitivity，DTH）反应6.2.2.1 受试物同6.1.1.16.2.2.2 实验动物及饲养环境选用近交系小鼠，如果已知受试物对其中一种性别的动物更敏感，则应使用这种性别的动物。
雌性动物应未孕、未产动物6 ~ 8周龄时开始试验，试验开始时每一性别的动物体重差异应控制在± 20%内动物的性别和数量、饲养环境同6.1.1.26.2.2.3 剂量分组、受试物给予方式及临床观察同6.1.1.3 ~ 6.1.1.56.2.2.4 试验方法在给予受试物结束前4 d，用牛血清白蛋白致敏动物，1 ~ 2周后用相同的抗原进行激发，激发后24 ~ 48 h，比较受试物组和对照组DTH反应的差异，以激发前后反应的差值来表示DTH的程度该方法是一种检测受试物对实验动物诱导性DTH影响的体内方法开展该试验时，应对如下因素进行考虑：（1）DTH检测方法有数种，如耳肿胀法、足跖增厚法等，应选用灵敏度高、可重复性好、并适用于所选用实验动物品系的方法；不同的方法中下列参数也可能不同，如致敏及激发动物所用抗原的性质，免疫注射的次数及途径，免疫激发的时间，同位素的使用等试验时选用的这些参数及其他相关的参数应可以使所选用的实验动物产生足够的DTH反应2）测定DTH反应前，应对动物给予受试物至少28 d6.2.3 细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T-lymphocyte，CTL）检测6.2.3.1 受试物、实验动物、剂量分组、受试物给予方式及临床观察同6.1.1.1 ~ 6.1.1.5。
6.2.3.2 试验方法该方法用于证明给予受试物至少28 d对CTL生成的影响常取动物脾淋巴细胞进行细胞毒性T淋巴细胞试验，检测采用放射免疫法或流式细胞术放射法使用同种异品系肿瘤抗原对CTL进行诱导（体内或体外诱导），然后，来自受试物组和对照组动物的脾细胞与51Cr标记的同种异品系肿瘤细胞共孵育4 h后，肿瘤细胞所释放的放射性标记物的量可以说明T淋巴细胞溶解肿瘤细胞的能力试验时，考虑如下因素：（1）应设立对照组来测定效应细胞不存在时靶细胞释放的放射性标记物的本底量和放射性标记物的总释放量2）应可以证明试验中所选用的动物可产生CTLs，所选用的试验方法应适合于诱导动物CTL的生成3）CTL检测有数种不同的方法，引用某一种方法时应做到完全引用，对方法进行修改时应予以说明，合适的情况下应说明主要试剂的来源、活性和/或纯度6.3 NK细胞的活性6.3.1 受试物、实验动物、剂量。