细胞工程第一章 植物组织培养简介 细胞工程(Cell Engineering)：在体外培养生物细胞，并对细胞进行生长与分化的调控、遗传重组与改良，使其生产出人类所需要的产品技术：细胞培养、分化调控、细胞融合、细胞器移植、转基因等产品：（1）细胞、组织、器官、个体 （2）有用物质——天然药物、色素、香精、抗体、多肽药物、蛋白质、酶、等Dolly诞生的意义：（1）大型哺乳动物的克隆技术成熟；（2）证明了高等动物的细胞全能性；（3）为人们快速繁殖优良动物、改良动物、利用动物作为生物反应器生产药物（疫苗、多肽类药物、激素等）带来了希望植物组织培养=培养植物组织=无菌培养(aseptic culture)、离体培养(in vitro culture)：在人工培养基(artificial medium)上无菌培养整株植物或植物的器官、组织、细胞或原生质体植物组织培养的类型：1.植株培养(Plant Culture)：在容器中无菌培养完整的植株植株来源：由种子无菌萌发而来；通过器官、组织、细胞再生而来在快速繁殖中，后期的成苗和壮苗阶段属植株培养。
一般时间较短，但也有培养时间长的，直接形成产品2.胚培养 (Embryo culture)：无菌培养植物的成熟胚或未成熟胚，使其形成正常的植株目的：①促进胚的提早萌发，缩短育苗时间；②克服远源杂种胚的夭折，以获得新的育种材料；③在科学研究中，用胚培养所得到的幼苗作为其它试验的材料3.器官培养(Organ Culture)：无菌培养植物的根、茎、叶、芽、花、果等器官,使其增殖或形成其它的组织或器官等4.组织培养(Tissue culture)：指无菌培养植物各种组织（如分生组织、形成层、木质部、韧皮部、皮层、薄壁组织、胚乳等），或由外植体分化形成的愈伤组织（callus），使其增殖或者分化愈伤组织（Callus）：具有旺盛分裂能力，但没有组织和器官分化的细胞群5. 花药与花粉培养：无菌培养植物的花药（带花粉）或花粉，形成单倍体植株有效的育种辅助手段：单倍体植株获得以后，通过染色体加倍，即得到可以稳定遗传的纯合二倍体，缩短植物育种年限6.细胞培养 (Cell culture)：无菌培养植物的单细胞或小细胞团可用于：植物克隆、细胞系的诱变和变异体的筛选、生产有用化合物（useful chemicals）。
7.原生质体培养 (Protoplast culture)：将无细胞壁的原生质体培养成愈伤组织或植株由于无细胞壁的障碍，原生质体是实现远缘植物间大规模遗传物质重组的良好体系植物组织培养简史：1838年：Schwann 和Schleiden在细胞学说基础上提出了细胞全能性（totipotency）假说：一个高等生物（动物和植物）身上所有的体细胞(somatic cells)均来自一个共同的细胞——合子(受精卵）；在适当的条件下，一个体细胞应能像合子一样可以发育成一个完整个体细胞全能性假说是开展植物组织培养研究的理论基础；验证细胞全能性假说是开展植物组织培养研究的动力1902年：德国植物学家Gottlieb Haberlandt在世界上首次开展了植物组织培养研究，他分离和培养了许多植物的叶肉细胞、髓细胞、气孔保卫细胞结果：细胞成活了数周，但不分裂、不增殖，以失败告终失败的主要原因：当时人们对植物细胞生长发育的了解太少规律？营养条件？所用的培养基成分太简单，没有维生素和植物激素，特别是当时人们还没有发现植物激素1904年：Hanning成功地培养了萝卜和辣根的胚，使其提早长成小植株1922年：Knudson成功地进行了兰花种子无菌萌发，促进了兰花育种、种苗生产和栽培，既而兰花产业的发展。
显现了植物组织培养的应用价值1925年：Laibach进行了亚麻种间杂种幼胚培养，成功地获得了杂种植株1934年-1935年：器官培养获得成功White(怀特)成功地进行了番茄根尖离体培养，继代培养达400余天培养基使用了含有丰富B族维生素的酵母提取物(yeast extract)， 发现了VtB对植物组织培养的重要性1937年： White设计了第一个培养基，为White培养基(怀特培养基) 1939年：组织培养获得成功 上世纪30年代发现了生长素（IAA) ， Gautheret，Nobecourt和White等在培养基中加入生长素，成功地培养了山毛柳、黑杨等植物的形成层，使其形成了愈伤组织(callus)，并且发现愈伤组织可在生长素培养基上大量增殖, 证明了生长素对植物细胞分裂的重要性1943年：White出版了《植物组织培养手册》专著，植物组织培养成为一门新的学科1940’S-1950’S：植物细胞培养技术出现重大突破1948年: Skoog 和Tsui（崔徵）发现了腺嘌呤与生长素的配合可以控制烟草愈伤组织形成芽与根1950’S：发现了细胞分裂素1957年：Skoog和Miller发现用激动素可以代替腺嘌呤，烟草愈伤组织形成芽的效果增加3万倍；发现了细胞分裂素与生长素的浓度比值决定着愈伤组织根或芽的形成。
细胞分裂素/生长素的比值：高：形成芽；低：形成根；相当：愈伤组织增殖，但不分化=植物器官分化的激素调控模式：具有普遍性：在很多植物上得到证明；是进行植物组织培养技术研究最重要的指导思想1952年：法国植物学家 Morel等培育了世界上第一例脱毒植物-大丽花（取分生组织培养）1958年：第一次证明了细胞全能性假说Reinert J. 和 Steward F. C 成功地将胡萝卜单细胞培养成完整的植株1959年：Morel发现了兰花的快速无性繁殖方法拟原球茎（protocorm-like body=PLB）途径1960年：Cocking 创造了酶解法生产原生质体技术，为原生质体培养、融合和细胞重组打下了基础1962年：Murashige和Skook 发表了著名的植物组织培养基——MS培养基（最常用）1967年：Bourgin和Nitsh等通过花粉粒培养获得烟草单倍体植株1971年：Takebe等首次将烟草原生质体培养成完整植株1972年：Carlson等通过原生质体融合进行烟草种间杂交，并获得了第一个种间杂种植株1970S-1980S年：德国Reihard等在药用植物细胞培养方面取得重要进展，成功地进行了治疗心脏病药物（地高辛）的生物转化1979年：日本用植物细胞发酵方法大规模培养人参细胞，商业化生产人参皂甙。
1985年：日本Mitsui（三井）石化工业公司用紫草细胞培养商业化生产紫草素（色素，抗菌抗病毒，用于化妆品）1985年：Horsch等报道了农杆菌介导的烟草转基因方法烟草叶片浸泡在农杆菌溶液中，通过筛选和植株再生，获得了具有外源基因的植株，即转基因植株（transgenic plant），创建了现代植物生物技术—植物基因工程植物组织培养技术的应用：1. 植物科学研究的有效手段：①可以提供均匀一致的试验材料（细胞、组织、器官、植株）；②研究细胞分裂、生长、分化、细胞壁再生等过程与机理；③研究基因的功能2.快速繁殖优良植物3.挽救和保存植物的优良品种：①通过分生组织培养可以重新获得无毒植株（virus-free plant），并可以通过超低温保存，长期保存无毒植株的种质；②用于挽救濒危植物资源4.改良植物性状：⑴胚培养：可挽救远源杂交胚、获得远源杂种植株；⑵花药（花粉）培养：可获得单倍体，提高选择效率、缩短育种年限；⑶原生质体融合技术：可克服有性杂交不亲和，创造远源杂种、甚至新的物种；⑷细胞培养技术：可用于细胞突变，更有效筛选突变体⑸离体再生技术为培育转基因植物提供了保障：5. 生产有用物质：药品、色素、香料等物质（研究用红豆杉植物细胞培养生产紫杉醇）植物组织培养技术的优点：1. 不受气候、季节和地理位置的影响；2. 不受病虫害的影响3. 植物生长发育过程容易调控，容易根据市场需求调节生产；4. 效率高、质量好第二章 植物组织培养的设施一、 化学试剂：用于配制培养基无机试剂：硝酸钾、硝酸铵、硝酸钙、硫酸钾、硫酸镁、硫酸铵、硫酸铜、硫酸亚铁、磷酸氢二钾、氯化钙、硼酸、钼酸钠等。
有机试剂：维生素(B1、 B6、烟酸、生物素）、氨基酸、糖（碳源）、植物激素、凝固剂以及其它一些物质二、 无菌设备1. 灭菌锅（autoclave）：最常用消毒的工具种类多：手提式（如常见的医用消毒锅，体积小）、立式（体积中等）和卧式（有中型和大型）之分；有自热式（带有加热装置）和外热式（无加热装置，需要从外部加热，如煤气、电炉、蒸气等）之分使用什么样的灭菌锅，要根据植物组织培养的规模而定2.超净工作台（laminar air-flow cabinet）：细胞工程中必不可少的一种设备，极端重要，用于对植物材料进行无菌操作超净工作台=空气过滤器，空气经过1~2次粗滤后，最后通过孔径为0.2~0.4μm的滤网超净工作台可以分为双人和单人、单面和双面、水平风和垂直风等类型三、培养室（Culture room）植物材料需在一个可控温、控光、洁净的地方进行培养如规模小，则有1~2个培养箱即可培养箱体积小，不占地方，控温、控光条件好，很适合于摸索植物材料的培养条件和科学研究缺点是空间小、价格昂贵（10000元/台）如果要培养较多的植物材料，应建立专门培养室培养室所需要的设备：1.培养架:培养架的设计既要考虑充分利用培养室的空间，也要考虑取放材料方便。
2.加温/降温设备：空调3.光照和控光设备:分为光培养室和暗培养室光培养室常用日光灯照明，并安置控制光照时间的自动开关四、培养容器1. 玻璃容器：如试管、三角瓶、果酱瓶、罐头瓶、饮料瓶等玻璃瓶耐高温消毒、透明（便于观察），且为惰性物质，对植物材料的生长影响小，是组培中用得最广的容器，但容易破碎2. 透明塑料容器：轻巧，不易破碎，但不耐反复高温消毒，而且有些塑料容器在高温消毒时会释放一些有害的物质，影响材料的生长3. 容器封口：良好的封口用品要求做到既可以防止污染和容器内水分的过分散失，又要做到透水、透气专用的组培容器有自己的盖子如果没有，可用棉塞、封口膜、锡箔纸、耐高温的塑料纸（如培养食用菌的聚丙烯塑料袋）封口棉塞最好瓶盖、瓶塞、或者封口膜的透气性能对材料的培养有显著影响，透气性能不好的，容器中湿度高（饱和），容易导致植物材料出现玻璃化（生理病态，植物材料呈水渍状，深绿色，刚脆，无继续培养的价值）五、其它仪器设备与用具1. 天平：需要1台万分之一的精密分析天平和百分比之一或十分之一的普通天平2. 冰箱：用于储藏一些不宜在常温下较长时间放置的药品和试剂，如维生素、氨基酸、激素、微量元素等。
3. 蒸馏水器或者去离子水生产装置4. 酸度计：植物生长需要一定的pH值，因此需要调节培养基的pH值酸度计测定pH值精度高，准确，但较烦琐如不进行要求很高的培养（如单细胞培养、原生质体培养），可以用pH试纸代替5. 酒精灯6. 解剖刀和镊子 7. 摇床植物组织培养室的设计植物组织培养工作按内容不同可分为3个过程：1.培养基的准备：试剂的配制、容器的洗涤、培养基的制备与消毒等：2. 植物材料的无菌操作(接种）：3.植物材料的培养、观察与分析第三章 植物组织培养基（Plant Tissue Culture Medium）培养基的重要性：营养来源；调节生长与分化的主要途径培养基种类比较多，共同之处：含有植物生长发育所必须的营养物质和生物活性物质不同之。