第二章 核酸的基本操作技术本章的主要内容• 核酸的提取• 核酸的检测与保存• 核酸的凝胶电泳• 核酸的分子杂交第一节 核酸的提取一、DNA的提取二、RNA的提取一、 DNA的提取DNA是生物的主要遗传物质，因而DNA的制备是基因工程的基础由于生物形式的多样性（细菌、植物、动物），以及DNA在生物体中存在形式的差异（染色体、线性DNA、质粒），因此，制备DNA的过程和方法也不相同一）DNA在生物体中的存在形式1、染色体DNA 是生物体遗传信息的主要载体 * 原核生物染色体：结构简单，储存的信息相对较少* 真核生物染色体：结构复杂，储存大量的遗传信息 用途：分离目的基因，研究基因的调控与表达4、叶绿体和线粒体DNA： 构建克隆载体，分离目的基因3、病毒DNA：构建克隆和表达载体，分离目的基因2、质粒DNA（染色体外遗传物质）特点：能自我复制，大小不一，在体内以超螺旋形式存在，在体外以超螺旋、开环和线形存在用途：构建克隆、表达载体，分离目的基因（二）DNA提取的一般步 骤 准备生物材料：选用的材料应处于提取DNA得率最高的生长期如 ：提取大肠杆菌质粒DNA，菌液应培养至对数生长后期( 测定OD600值）；提取植物DNA，最好选取幼嫩的部分 。
分离和提取DNA：总DNA，酚／氯仿等抽提；叶绿体／线粒体DNA，一般采取先提纯细胞器，再溶解 细胞器膜，待释放出细胞器DNA后，再进一步提取纯化之 质粒DNA，要将其与染色体DNA分开裂解细胞：对于原核生物可用溶菌酶、冰冻和超声波等法；对于 结构复杂的动植物材料先粉碎，然后用液氮研磨或匀浆三）细菌总DNA的制备（E.coli）1.菌体培养: 将活化的菌体接种于LB(Luria- Bertani)培养基，于37 oC培养至对数生长期,然后置冰水浴20min2.收集菌体: 离心(5000 g， 5 min) (50 ml)3.菌体裂解: 加5ml冷 TES(0.1 M Tris-HCl,0.1 M EDTA，0.15 M NaCl，pH 8.0)加10 mg 溶菌酶，于37 oC 温育10 min4.去RNA: 加入1 mg RNaseA，于室温温育15 min5.去蛋白: 加入0.6 ml 10% SDS和Protease K(0.1mg/ml)，50 oC，3h，加苯酚-氯仿抽提(等体积)6.沉淀DNA: 加入1/10 V 的NaAc，2 V 无水乙醇以玻璃棒缠绕絮状沉淀，溶于TE Buffer中有时还需要加入CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）除去细菌多糖。
基本原理：CTAB可溶解细胞膜，与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的；在低盐溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开；然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，而CTAB溶于乙醇特点：能较好的去除糖类杂质，对于含糖较高的材料最为合适;在提取前期能同时得到高质量的DNA及RNA提取的思路： 质粒的特性：共价闭合、环状的小分子量DNA要去除的物质： 基因组DNA（调节pH从12.6降到7.0左右）蛋白质（SDS和蛋白酶变性，苯酚-氯仿 抽提） 脂类及小分子杂质（乙醇等）RNA（RNase)（四）细菌质粒DNA的提取—— 碱裂解法闭合环状的质粒DNA，在变性后不会 分离，复性快；1、原 理DNA双链变性DNA单链复性强碱中性染色体线性DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去变性2 、所用的试剂作 用① 溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽 聚糖中的-1，4糖苷键 在碱性条件（pH>8）下有活性② 葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。
③EDTA Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活 性，防止DNA被酶降解 ④NaOH-SDSNaOH：强碱，提供pH>12的碱性条件，使 DNA双链变性SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结 合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括 DNA酶）变性沉淀冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8用来中和NaOH变性液，使DNA复性⑤ NaAc-HAc缓 冲液⑥ 酚-氯仿蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀苯酚用来抽提蛋白，氯仿用来抽提苯酚⑧ RNase A降解RNA渣滓以免提取后的DNA中含有小分子的RNA用于沉淀DNA⑦ 乙醇DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境⑨ TE缓冲液DNA保存液由Tris-HCl和EDTA配制 Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲液），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解3、碱抽提法提取质粒DNA的步 骤 Solution I 的配制：使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁第一步：溶菌50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl(pH8.0)， 10mM EDTA， 4-5mg/ml溶菌酶， RNase A溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。
第二步：破膜，蛋白质和DNA变性Solution II 的配制（现用现配）：第三步：中和溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀Solution III的配制：0.2M NaOH，1.0%SDS3M 醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8）上清液中含有闭合质粒DNA第四步：离心除去沉淀0.6倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇第五步：纯化DNA酚-氯仿抽提第六步：沉淀DNA最重要的是：4、 影响质粒DNA产量的因 素菌株的遗传背景， 质粒自身的拷贝数一般要使用endA基因发生突变的大肠杆菌菌株如DH5、JM109、TG1等1）受体菌株endA基因编码核酸内切酶Ⅰ，在Mg2+的存 在下可将双链DNA消化成7bp的寡核苷酸片段这是直接决定DNA产量的重要因素之一3）质粒大小分子量大的质粒，拷贝数少2）质粒拷贝 数质粒本身的性质所决定若干常用质粒的理论产量质粒名分子大小bp拷贝数质粒产量 g/ml pGEM pUC pBR322 ColE1 pACYC pSC1012700 2700 4400 4500 4000 9000300-700 500-700 >25 >15 ≈10 ≈61.8-4.1 2.9-4.1 >0.32 >0.15 ≈0.09 ≈0.12（五）动物细胞DNA的提取提纯的思路：动物DNA的特性：分子量较大，易断，提取过程中应尽量避免剧烈的搅拌，并注意抑制组织中DNase的活性。
要去除的杂质：RNA、蛋白、多糖、脂类及各种小分子杂质一般过程及原理：动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研磨成细粉末 组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用1）组织粉碎0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K，50 oC温育2）细胞裂解（3）纯化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染SDS是离子型去垢剂（detergent），可以使 细胞膜崩解5）除去RNA污染用RNase用无水乙醇或异丙醇4）沉淀DNA（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀）（六）植物基因组DNA的提取提纯的思路a、植物DNA的特性：分子量较大，易断，提取过程中应尽量避免剧烈的搅拌，并注意抑制组织中DNase的活性，同样要去除蛋白、多糖、脂类、 小分子物质等杂质b、植物细胞具有细胞壁，不易破碎，并为了保持其DNA完整性，可采用去污剂温和处理法破碎细胞，对于破碎较困难的材料，还可辅加蛋白酶K，在酶的存在下共同破碎细胞一般过程及原理： （1）组织粉碎用液氮冷冻后研磨成细粉末2）细胞裂解用1% SDS和蛋白酶K，50 oC温育用异丙醇或无水乙醇（3）纯化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染4）沉淀DNA（5）除去RNA污染用RNase A。
可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀） 提取思 路RNA80-85% rRNA10-15% tRNA及小分子RNA1-5% mRNA抑制内源及外源性RNase去除蛋白：酚/氯仿抽提DNA: DNase多糖、色素：酚/氯仿抽提小分子杂质：乙醇洗l提取细胞总RNA可采 用异硫氰酸胍一步法或 盐酸胍-有机溶剂法l异硫氰酸胍和盐酸胍 是强烈的蛋白质变性剂 ，使蛋白质的二级结构 解体，核蛋白与核酸分 离，抑制内源性RNase二、RNA的提取u试剂专用，最好使用新开封的u器皿、取液枪专用u勤换手套u分小份保存试剂，用后丢弃u用DEPC处理器皿、枪头等， 后高压灭菌u用0.1%DEPC处理溶液后高压 灭菌uRNA纯化时加RNase抑制剂去除RNase影响RNase抑制剂l DEPC：焦碳酸二乙酯，可非特异的修饰蛋白质和RNA，可用于灭活缓冲液和器皿 中的RNase，高压灭菌后， DEPC可分解掉，但其具有致癌危险，应在通风厨内操作DEPC在Tris和其它胺类缓冲液中的半衰期很短，不能用 于处理这些缓冲液l 异硫氰酸胍：mRNA的提取l mRNA的提取对于进一步研究基因的结构及其表达调控是必要的。
mRNA占RNA总量的5％左右，主要存在于细胞质中，且大部分与蛋白质结合在一起形成核蛋白体l 真核mRNA的提取通常有两条途径：a.先提取总的RNA，再从中分离mRNA；b.先提取多聚核糖体，再将蛋白质与mRNA分开l 利用寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸纤维素柱层析，把mRNA与其它的RNA分开因为几乎所有的mRNA3’端都具有polyA的序列，而tRNA和rRNA上都没有这样的结构进行oligo(dT)-纤维素柱层析时，只有3’端有polyA的mRNA才与oligo(dT)结合，从而达到与其它RNA分离的目的l 要成功的提取mRNA，也应尽可能完全抑制或去除RNA酶的活性寡聚(dT)-纤维素柱法提纯mRNA的过程柱平衡（以上柱缓冲液洗脱纤维素柱，至柱流出液的pH值小于8.0) 装柱( RNA水溶液于65℃温育5min，迅速冷却后按 RNA水溶液︰ 上柱缓冲液=1 ︰ 1混合装柱 洗涤(以5-10V的上柱缓冲液将未与柱结合的RNA等洗脱下来） 洗脱(以2-3V的无RNA酶的洗脱缓冲液洗脱)重复装柱、洗涤、洗脱步骤 沉淀(1/10 V的3 M NaAc,pH 5.2; 2 V 无水乙醇；置于冰浴中至少30min) 溶解(重蒸水或TE中)第二节 核酸的检测与保存一、核酸的检测 • 紫外光谱分析法、荧光分析法、凝胶电泳法1、紫外分光光度法测定DNA和RNA的含量前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。
测定浓度应大于0.25μg/ml结论：在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37μg/ml；RNA为40ug/ml紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤a．吸取一定量的DNA样品或RNA样品，加水至特定体积后，转入分光光度计的石英比色杯中b．分光光度计先用一定量的水校正零点c．测定待测样品在230nm、260nm和280nm的OD值d．计算浓度双链DNA样品浓度(μg/μl)= OD260×核酸稀释倍数×50/1000；RNA样品浓度(μg/μl) = OD260×核酸稀释倍数×40/1000e．分析纯度1) OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染2) OD260/OD280小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；3) OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等测定结果分析A、测DNA：纯的DNA样品OD260/OD280应约为1.8， OD260／OD230应大于2.0B、测RNA纯的RNA样品其OD260／OD280应介于1.7-2.0之间 ，OD260/OD230比值。